高效液相色谱故障排除1

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1、液相色谱仪和色谱柱故障排除故障排除发现问题定位问题纠正问题防止问题的再发生主要规则故障特征1.色谱峰展宽2.压力升高螺丝、金属箍、毛细管相应的对策1.用配套的螺丝、金属箍和毛细管2.连接进样器和色谱柱之间的管道(柱外死体积)应尽可能地短螺丝、金属箍和毛细管故障死体积连接螺丝包括一个螺母和一个套在毛细管上的金属箍；它们必须和完全匹配当完全匹配时，毛细管的顶端将和仪器或柱子的端口恰好吻合，而不至于形成死体积死体积会导致出现肩峰和双重峰注意：不同生产厂家的螺丝和金属箍是不能通用的。螺丝、金属箍、毛细管毛细管1.从泵到检测器所有毛细连接中，毛细管的内径应逐渐减小。(如泵-进样器连

2、接用内径为0.5mm的毛细管；进样器-柱子以及柱子-检测器连接用0.2mm的毛细管)3.大内径的毛细管导致宽峰4.太长的管子导致峰的分辨率差，特别是换用微径柱时2.在使用微径柱(3mm或2mm)或梯度解吸时，选择合适内径和合适长度的毛细管尤为重要注意：使用短的和内径小的毛细管可以将和毛细管有关的柱外体积效应降到最低螺丝、金属箍、毛细管流动相的准备1.使用色谱纯的溶剂和优级纯的试剂2.用S&S公司的0.45µm的滤膜将所用的溶剂和缓冲溶液过滤3.使用HPLC级(或梯度级)的溶剂(如MERCK的溶剂事先都经过过滤)4.使用醋酸盐缓冲溶液比使用磷酸盐缓冲溶液要好，但应注意醋酸盐缓冲液在

3、近紫外区的吸收5.使用酸或碱准备缓冲溶液要比使用盐好6.使用0.04%的叠氮钠溶液以防止流动相长菌溶剂流动相脱气使用不脱气或脱气不完全的流动相会导致形成气泡、泵性能不稳定、检测器噪音高以及其它检测器故障注意：1.加热是流动相脱气的最好方法，但不方便2.氦气脱气也很方便，仅需几分钟就可以完成3.真空过滤脱气效果较差，但很方便，也很经济，不失为一常规办法溶剂溶剂纯度的影响溶剂中的杂质会导致出现“鬼峰”，特别是梯度解吸时注意：只能使用色谱级的溶剂!不能使用旧的或未经过滤的缓冲溶液溶剂溶剂混合产生的问题流动相中所使用的不同溶剂必须互溶注意：过高浓度的磷酸盐缓冲溶液可能会在有机溶剂中析出流

4、动相中溶剂不互溶会导致:1.基线漂移，2.保留时间的重现性差，3.出现肩峰和“鬼峰”的问题.溶剂样品的溶解样品应该溶解于流动相中，如果样品在流动相中的溶解性实在太差，则应将进样体积降到很低(如1µl)选用不合适的溶剂溶解样品可能会导致保留时间的重现性差，肩峰、双重峰和“鬼峰”溶剂缓冲溶液和离子对系统1.应保持缓冲溶液的浓度在20mM到50mM之间，以获得最佳的分析结果2.浓度过低的缓冲溶液体系会导致峰形差，分辨率低3.一种缓冲溶液的最有效的缓冲pH范围是偏离其pKa值1pH单位不同缓冲体系的缓冲范围缓冲溶液种类pKa缓冲范围磷酸盐2.11.1-3.17.26.2-8.212.3

5、11.3-13.3醋酸盐4.83.8-5.8柠檬酸盐3.12.1-4.14.73.7-5.75.44.4-6.4溶剂故障特征“鬼峰”(由已被污染的过滤头造成)保留时间不断改变(由于过滤头堵塞或部分堵塞)清洗步骤：1.水2.稀硝酸3.水4.异丙醇5.水(超声波清洗)流动相过滤头产生的问题溶剂进样体积进样量过大会导致峰形不对称以及保留时间变短的问题通常引起色谱柱过载或超出检测器的检测限是由于样品浓度过高而不是体积的问题过大的进样体积会导致产生宽峰注意：使用微径柱时，必须保证柱子不要过载进样SamplesizeeffectsSampleamount1µg/gsilicaok10µg/g

6、silicaprobablyok100µg/gsilicaoverloaded;okforpreparativeLC进样-色谱柱过载获得高重现性结果的要求各批次之间的重现性好每根柱子之间的重现性好峰形对称分离效率高，选择性好色谱柱故障的原因柱子的寿命63%反压升高23%重现性变差18%分离效率降低12%色谱柱避免问题的“秘诀”使用预柱保护分析柱（硅胶在极性流动相/离子性流动相中有一定的溶解度）大多数反相色谱柱的pH稳定范围是2-8.0避免流动相组成及极性的剧烈变化流动相使用前必须经脱气和过滤处理如果使用极性或离子性的缓冲溶液作流动相，应在实验完毕将柱子冲洗干净，并保存在乙腈中压力

7、升高是需要更换预柱的信号色谱柱非极性固定相(如反相色谱填料RP-18,RP-8等)的再生：水乙腈氯仿(或异丙醇)乙腈水0.05M稀硫酸可以用来清洗已污染的色谱柱色谱柱的再生直接将色谱柱连接到泵，每种清洗溶剂用20倍柱体积极性固定相(如Si,NH2,CN,DIOL基色谱填料)的再生：正庚烷氯仿乙酸乙酯丙酮乙醇水注意：在通常情况下，最好是更换色谱柱；花费太多的时间用于色谱柱再生而不能保证正常的分析工作是得不偿失的。色谱柱柱外死体积柱头的死体积会导致产生双重峰或脱尾峰