强筋益髓灵对大鼠截瘫作用机制的研究

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1、强筋益髓灵对大鼠截瘫作用机制的实验研究杜立建'，冯胜格2,王扬彳吴俊喜"（1.石家庄市中医院；2.石家庄炎黄中医研究院；3.河北师范大学校医院；4河北省中医院审校）关键词：强筋益髓灵截瘫细胞凋亡神经胶质纤维酸性蛋白（glialfibri11aryacidicprotein,GFAP）截瘫，是指脊髓损伤后，受伤平面以下双侧肢体感觉、运动、反射等消失和膀胱、肚门括约肌功能丧失的-•种病症。其中，上述功能完全丧失者，称完金性截瘫，述有部分功能存在的，称不完全性截瘫。早期为弛缓性瘫痪，约3〜4周后，逐渐转为痉挛性瘫痪。截瘫病因与脊髓外伤或本身病变有关。1材料

2、：1.1实验动物：南方医科人学实验动物中心（许可证号：SCXK（粤）2004-0020）提供的SPF级健康成年SD大鼠120只，体1.0^1.6kg,随机分为5组（即空白组、模型组、药物对照组、大剂量治疗组、小剂量治疗组），每组24只。每口定量供给混合动物饲料和充足水，在安静、通风、清洁环境下分笼饲养，饲养坏境温度控制在22°C〜25°C,相对湿度40%〜70%。1.2实验药物：强筋益髓灵（由黄代30.制马钱子5g、人参20g、口术20g、胆星10g、土鳖虫12g、水蛙10g、地龙15g、僵蚕12g、小口花蛇1条、娱蚣3条等组成），等组成。由石家庄炎

3、黄屮医研究院提供，并由石家庄炎黄屮医研究院制成汤剂。银杏注射液5ml/支,由山西银湖制药有限公司提供牛产批号：104098。1.3实验试剂及仪器：GFAP试剂盒（批号：20051027）华美生物公司；即用型兔抗人鼠多克隆GFAP抗体（工作浓度为1:100）及ABC试剂盒均由武汉博丄徳牛•物工程公司提供;SP试剂盒北京中山公司；DAB显色剂（批号：41081198）北京中山公司TUNEL凋广试剂盒（R&D公司）1.4实验器材:KU0TA13100高速离心机Beckman；58108型离心机Eppendorf；Milli-QUF纯水机France；-20

4、°C冰箱SANYO；干燥箱湖北黃石医疗器械厂；DJ-1磁力搅拌器江苏金坛荣华仪器制造有限公司；PB203-E精密天平MettlerToledo（shanghai）；PHS-3CpH计上海康仪仪器有限公司；紫外透射分析仪上海天能公司；KodakEDAS290数码照相凝胶成像系统Kodak；低温髙速台式离心机KUBOTA；手掌式离心机M1LL1PORE；WH-861旋涡混合器上海市环球物化仪器厂2.实验方法2.1实验动物模型制作：适应性喂养7天后，除空口组外，其余四组均行体积分数为0.15的水合氯醛腹腔注射麻醉（300mg/kg）人鼠，以T9〜T11节段

5、骨性标志为小心，沿棘突做纵行切I」约4cm,切开皮肤及浅筋膜并皮下游离，于T10节段处，用锐利刀片于硬膜外快速切割、完全横断脊髓，切除2咖脊髄疔段，并见大鼠尾巴痉挛性摆动，双下肢及加体回缩扑动后，双下肢瘫痪，表明脊髓全横断模型制备成功，医用明胶海绵填充脊髓断端间隙。2.2试验分组处理情况：空白对照组：牛理盐水灌胃1次/日，剂量2ml;模型组：生理盐水灌胃1次/口，剂量加1；药物対照组：银杏注射液静脉注射1次/FI，剂量5ml;大剂量治疗组：中药强筋益傩灵灌胃1次/LI,剂量5ml(40g/kg);小剂量治疗纽：中药炎黄四虫通脉灌胃1次/日,剂量5ml

6、(20g/kg)，喂养8周。2.3实验指标及测定方法2.3.1川改良的Tarlov法评价造模后24及8周后观察大鼠下肢运动功能情况:Tarlov评分⑴：测评大鼠后肢运动功能状况。0分：没有口主性运动；1分：仅有髄、膝关节的非反射性运动；2分：有瓠、膝、距小腿(踝)4个主要关节的运动；3分：能主动支持体质量和不协调步态，或偶尔出现协调步态；4分：前肢和后肢协调的步态，行走时有趾间关节的运动；5分：正常步态。2.3.2光镜下观察脊髓组织的病理形态学改变:氯胺酮(30mg/kg)静脉麻醉下，行4%多聚卬醛+0・2%戊二醛液经左心灌注处死，取出脑与脊髓，置于

7、相同灌注液中4°C下再固定48小时。解剖显微镜下将大鼠脊髓(C1〜T6)则行3mm层厚轴位切开，肉眼观察记录。制作6um厚连续切片，HE染色,供光镜观察;部分标本再作成1伽3大小的组织块，2%戊二醛、1%四氧娥酸再固定，618环氧树脂包埋、超薄切片，醋酸铀-枸椽酸铅染色，H-500透射电镜下观察。2.3.3采用ABC染色测脊髓组织中GFAP的表达量。免疫组织化学染色用ABC法进行检测步骤：⑴切片常规脱蜡入水;⑵新鲜配制3%H202,室温处理3-10min,以消除内源性过氧化酶活性;⑶蒸馆水洗涤2min,PBS浸泡5min;(4)微波修复，暴露抗原;⑸

8、蒸馆水洗涤2min,PBS浸泡5min;(6)5一10%正常山羊血清PBS稀释封闭,室温孵育lOmin;(7