《细胞工程》PPT课件

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1、细胞工程原生质体培养和体细胞杂交2011级8班唐元嫚植物原生质体：是去掉细胞壁的裸细胞。保持着植物细胞的全能性，而且仍能进行植物细胞的各种生命活动。是植物细胞工程和许多理论研究的理想材料。Eg:利用原生质体可以进行植物细胞膜的结构与功能，细胞壁的形成与功能，病毒侵染机理，植物激素作用机理等多方面的研究。是植物遗传转化的理想受体，而且为实现远源物种间的体细胞杂交，培育新种开辟了新的途径。植物细胞的全能性原生质体的分离与纯化原生质体的分离原生质体的纯化与活力测定原生质体的分离1、材料的选择由于叶肉细胞排列疏松，且叶肉原生质体有叶绿体，取材

2、也方便，因此叶肉是最常用的材料。对于单子叶植物和大多数双子叶植物而言，采用颗粒较小，疏松易碎的胚性愈伤组织及由其建立的胚性悬浮细胞系更容易获得高质量的原生质体，在培养中更容易得到持续的细胞分裂。无菌幼苗的子叶，下胚轴和根等也可用于原生质体的分离。供体的年龄，生理状态和生长环境等都可能影响原生质体的得率、质量以及以后的培养和再生，也影响实验的重复性。Eg:从生长在人工气候箱中的烟草植株的叶片获得的结果比田间材料得到的结果较稳定，并易于重复。2、材料的预处理作用：生理状态，增加细胞膜的可能是改变细胞和细胞壁的强度；也可能是改变细胞壁的化学

3、成分或是减轻酶溶液中杂酶对原生质膜的损伤，以提高细胞壁酶解的效率。方法：（1）暗处理（2）预培养（3）预萎焉（4）预质壁分离3、分离方法（1）机械分离法：是早期研究中借助于利器或机械磨损等措施使细胞壁破损，促使原生质体释放的方法。（2）酶分离法：酶分离法是指用不同种类和浓度的酶处理细胞，将细胞的壁解离，以获得原生质体。常用酶的种类：纤维素酶（cellulase);果胶酶（pectinase)；半纤维素酶（hemicellulase);崩溃酶（driselase);蜗牛酶（sanailase)。酶液的配置：一般由不同的酶制品、渗透稳定剂

4、（糖醇、可溶性糖以及无机盐）以及稳定质膜的药品（附加钙盐0.1%）组成，有时也加入少量缓冲剂或其他药品。（3）分离原生质体：a、两步分离法b、一步分离法①机械法优点：（1）能排除酶的有害影响；缺点：（1）原生质体的产量低；（2）方法繁琐费力；（3）局限性大图示：原生质体分离过程（以叶片为例）过滤、离心加果胶酶和纤维素酶原生质体的纯化与活力测定1、原生质体的纯化将包括处理过的材料在内的酶解混合液经过尼龙网或不锈钢网过滤（网孔视原生质体的大小而异），除去大的残渣，然后收集含原生质体的滤液，再洗涤纯化。方法:（1）沉降法：将滤液低

5、速离心，转速的控制以将原生质体沉淀而细胞碎片等杂质仍然悬浮在上清液为准。（2）漂浮法：是根据原生质体、细胞或细胞碎片相对密度不同而设计的，但用这种方法纯化，原生质体得率较低。（3）界面法：是利用高分子聚合物混合液产生两相水溶液的原理，离心可使原生质体处于两液相的界面之间，可获得数量较大的纯净原生质体。③界面法500mmol/L蔗糖140mmol/L蔗糖+360mmol/L山梨醇原理：选两种不同渗透浓度的溶液，其中一种溶液密度大于原生质体的密度，另一种溶液小于原生质体的密度。100mmol/LCaCL2+300mmol/L山梨醇+原生质

6、体2、原生质体活力的测定（1）形态特征形态上完整、含有饱满的细胞质、颜色鲜艳的正常球形原生质体为有活力的原生质体。（2）活体染色用0.1%酚番红或Evans蓝染色后进行观察，有活力而质膜完整的原生质体不着色，而死亡的原生质体能被染上色。（3）其他还可以用氧电极测定呼吸或测定原生质体的光合活性（绿色细胞）等方法来测定其活力。真正确定原生质体的活力还是要看原生质体能否进行持续有丝分裂并再生植株。原生质体活力检测形态识别：形态上完整，呈圆形，含有饱满的细胞质，颜色鲜艳的即为存活的原生质体。原生质体的活力测定-染色法原生质体培养培养基培养方法

7、原生质体的再生培养操作实例：三叶半夏的原生质体培养培养基1、无机盐一般认为原生质体培养基中大量元素应比愈伤组织培养基中的浓度低，对其培养效果影响最大的是钙离子浓度和氮源的种类及其浓度。2、渗透稳定剂常用的有葡萄糖、甘露醇、山梨醇、蔗糖、木糖醇和麦芽糖等。糖类是培养基中碳源，也同时是培养基渗透势的调节剂。3、有机成分含有丰富有机物质的培养基有利于细胞分裂，如被广泛应用于原生质体培养的KM8p培养基。4、植物生长物质一般认为，在培养基中加入2,4-D对分化却有抑制作用，因此，在愈伤组织形成后应该及时调整激素的种类和浓度。培养方法1、液体培

8、养（1）液体浅层培养将一定的原生质体悬液在培养皿底铺一薄层，封口后进行培养。（2）微滴培养微滴的大小很重要2、固体培养-琼脂糖包埋利用低熔点琼脂糖，可在30度左右溶化与原生质体混合而不影响原生质体的生命活动。（对混合时的