4 人工染色体载体

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1、第四章　人工染色体载体7/26/20211利用染色体的复制元件来驱动外源DNA片段复制的载体称为人工染色体载体。人工染色体载体:模拟染色体的复制方式，因此都能装载大片段的DNA片段。7/26/20212目前常用的人造染色体载体包括：细菌人工染色体载体（BAC）酵母人工染色体载体（YAC）黏粒载体（cosmid）P1人工染色体载体（PAC）7/26/20213pHC796400bpTcrlfragmentcosoriAprPstIBamHISalI1978年J.Collins和B.Hohn等人发明构建1.8kb

2、的l-DNA片段+pBR322片段装载范围为31-45kb。第一节　黏粒（cosmid）载体7/26/20214第一节　黏粒（cosmid）载体黏粒克隆载体（柯斯质粒载体）实际上是质粒的衍生物，是由英文“cossite-carryingplasmid”缩写而成的，其原意是指带cos位点的质粒。pHC796400bpTcrlfragmentcosoriAprPstIBamHISalI7/26/20215考斯质粒（cosmid）=质粒+cos序列。pHC796400bpTcrlfragmentcosoriAprP

3、stIBamHISalI它是用正常的质粒同λ噬菌体的cos位点构成。cos序列是l噬菌体DNA中将DNA包装到噬菌体颗粒中所需的DNA序列。7/26/20216黏粒它的大小一般5-7kb左右，用来克隆大片段DNA。克隆的最大DNA片段可达45kb。①质粒复制起点（colE1）象质粒一样转化和增殖。②抗性标记Ampr。③cos位点。有的粘粒载体含有2个cos位点。pHC796400bpTcrlfragmentcosoriAprPstIBamHISalI一、黏粒的结构特征和用途7/26/20217一、黏粒的结构特

4、征和用途能像l-DNA那样进行体外包装，并高效转染受体细胞；能像质粒那样在受体细胞中自主复制；重组操作简便，筛选容易；装载量大（45kb）且克隆片段具有一定的大小范围；不能体内包装，不裂解受体细胞。7/26/20218二、构建cosmid克隆载体的策略根据λ噬菌体克隆载体和质粒克隆载体两者的这些性质，取长去短，设计由质粒和含有cos位点的这种λDNA片段组装成一类新的克隆载体，即cosmid克隆载体。7/26/20219由λDNA片段和pBR322质粒DNA联合组成的。cosmid载体----pHC797/2

5、6/202110pBR322质粒(p43)7/26/202111用λ噬菌体基因组的cro—rⅡ的BglⅡ限制片段，取代pBR322质粒DNA的位于1459～1666bp之间的Sau3A片段，产生出具有BglⅡ单切割位点的重组体分子。然后通过这个位点，将带有cos序列、长度为1.78kb的λDNA之BglⅡ片段插入进去，于是得到了pHC79柯斯质粒.7/26/202112λDNA片段除了cos位点之外，在其两侧还具有与噬菌体包装有关的DNA短序列；质粒DNA部分则是一个完整的复制子。克隆能力为31～45kb，而

6、且能够被包装成为具有感染性能的噬菌体颗粒。7/26/202113三、cosmid克隆载体的特征①构建的cosmid克隆载体是一种环形双链DNA分子，—般在5--7kb。②cosmid克隆载体具有质粒的性质。包括以下4个方面7/26/202114cosmid克隆载体具有质粒的复制子，在大肠杆菌细胞内按质粒复制的方式进行复制，具有转化大肠杆菌的功能，并且在氨苄青霉素作用下，同样也会获得扩增。cosmid克隆载体通常也具抗菌素抗性基因，作为重组体分子表型选择标记。其中有一些还带上基因插入失活的克隆位点。7/26/2

7、02115③具有λ噬菌体的特性。在此克隆载体上含有一个cos位点。cosmid克隆载体在克隆了合适长度的外源DNA，并在体外包装成噬菌体颗粒之后，可以高效地转导对λ噬菌体敏感的大肠杆菌寄主细胞。7/26/202116进入寄主细胞之后的cosmid克隆载体DNA分子，便按照λ噬菌体DNA同样的方式环化起来。但由于cosmid克隆载体并不含有λ噬菌体的全部必要基因，因此它不能通过溶菌周期，无法形成子代噬菌体颗粒。外源片段克隆在黏粒载体中是以大肠杆菌菌落的形式表现出来的，而不是噬菌斑。7/26/202117④构建的

8、cosmid克隆载体较小，因此能承载比较大的外源DNA片段。如果cosmid克隆载体的大小为6.5kb，按入噬菌体容许包装的量计算，能承载的外源DNA片段最大可达44.5kb(即51kb～6.5kb)，最小的也有29.9kb(即36.4kb～6.5kb)，所以用这样的cosmid克隆载体能克隆40kb左右的外源DNA片段。7/26/202118四、cosmid克隆载体的工作原理cosmid克隆载体具