猪伪狂犬病毒抗体荧光免疫层析检测法.pdf

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1、ICS11.220B41团体标准T/CVMAX20—2019猪伪狂犬病毒抗体荧光免疫层析检测法TheDetectionofPRVAntibodybyHypersensitiveFluorescenceImmunoassay（征求意见稿）CVMA中国兽医协会2019—XX—XX发布2019—XX—XX实施中国兽医协会发布T/CVMAX20—2019前言本标准按照GB/T1.1-2009给出的规则起草。请注意本文件的某些内容可能涉及专利。本文件的发布机构不承担识别这些专利的责任。本标准由四川省兽医协会提出。本标准由中国兽医协会归口。本标准起草单位：四川省动物疫病预防控制中心，成都微瑞生物科

2、技有限公司。本标准主要起草人：陈斌、陈弟诗、周明忠、张毅、阳爱国、王泽洲、章建、邓飞、贺冬梅、丁梦蝶、裴超信、吴冠英、邱明双、张永宁、吴宣。CVMA中国兽医协会T/CVMAX20—2019猪伪狂犬病毒抗体荧光免疫层析检测法1范围本标准规定了猪伪狂犬病毒抗体(gB和gE)荧光免疫层析检测法的原理、仪器设备、操作步骤、结果分析。本标准适用于猪血清中猪伪狂犬病病毒gB和gE特异性抗体的快速检测。2规范性引用文件下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅注日期的版本适用于本文件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。GB19489实验室生物安全

3、通用要求GB/T6682分析实验室用水规格和试验方法GB/T18088出入境动物检疫采样NY/T541兽医诊断样品采集、保存与运输及规范3缩略语HFIA高敏荧光免疫分析方法（TheHypersensitiveFluorescenceImmunoassayHFIA)4原理采用免疫夹心法和高敏荧光免疫分析法相结合技术，检测动物血清样本中的猪伪狂犬病CVMA抗体(gB中国兽医协会和gE)。当血清样本中抗体与高敏荧光纳米微球标记的伪狂犬重组抗原接触反应后形成复合物，继续与硝酸纤维素膜上检测线包被的伪狂犬重组抗原形成夹心复合物反应，其余物质继续向前层析在C线捕获住“荧光标记鸡IgY+山羊抗鸡Ig

4、Y”免疫结合物，最后用高敏荧光分析仪读取检测卡上的荧光信号。5仪器、材料与试剂5.1仪器5.1.1高敏荧光分析仪：能在激发波长为(400±20)nm，检测波长为(615±10)nm条件下检测。5.1.2单道可调移液器（20～200μL）和（0.5～10μL）。5.1.3分析天平：0.0001g。T/CVMAX20—20195.1.4离心机。5.1.5冰箱。5.2材料5.2.1猪伪狂犬病毒抗体(gB和gE)阳性血清。5.2.2猪伪狂犬病毒抗体(gB和gE)高敏荧光免疫分析法检测试剂卡（图1）：硝酸纤维膜上包被有猪伪狂犬病毒重组抗原，用于样品中猪伪狂犬病毒抗体与高敏荧光纳米微球标记伪狂犬重

5、组抗原反应后，再与硝酸纤维素膜上包被的伪狂犬重组抗原反应。图1猪伪狂犬病毒抗体荧光免疫层析检测法试剂卡示意图5.3试剂5.3.1水：按照GB/T6682中的要求，二级。5.3.2样品稀释液（见附录A）。5.3.3镧系荧光纳米微球：荧光寿命≥400μsCVMA6样品采集与处理中国兽医协会6.1样品的采集应按照NY/T541-2002《动物疫病实验室检测采样方法》中的规定进行，并做好安全防护。按常规方法用干燥、洁净的离心管或适当容器采集3～5mL血液。6.2样品的处理血液样本用离心机3000r/m离心3min，血清量不少于500μL。6.3样品的贮存T/CVMAX20—2019血清样本在2

6、-8℃冷藏可保存24小时，如需长期保存应置-20℃或-80℃。7检测方法7.1样品稀释待检血清样本和猪伪狂犬病毒抗体荧光免疫层析检测法试剂卡从2-8℃取出，平衡到室温(25℃左右）。用样品稀释液将待测血清样本按1:20稀释。7.2加样从原包装铝箔袋中取出猪伪狂犬病毒抗体荧光免疫层析检测法试剂卡，置于平净平坦的台面上，用移液器吸取离心管中事先准备好的已稀释好的检测样本垂直滴加80μL于加样孔内。7.3检测避光层析15min后用高敏荧光分析仪检测。8结果计算B—高敏荧光分析仪读取标准溶液或样本溶液的检测卡上的荧光信号T/C值BO—高敏荧光分析仪读取稀释液检测卡上的荧光信号的T/C值以标准品

7、B-BO值的对数为纵坐标，以猪伪狂犬病毒抗体阳性血清效价对数为横坐标，CVMA绘制标准曲线图。将样本的荧光信号值代入标准曲线中，从标准曲线上读出样本所对应的样中国兽医协会本中猪伪狂犬抗体效价。注：软件自带计算功能，能准确算出当前样本T/C值所对应的猪伪狂犬病毒抗体效价。9检测结果判定标准猪伪狂犬gB抗体效价检测：检测结果大于32时抗体水平为阳性，小于16时抗体水平为阴性，16～32之间为可疑区。猪伪狂犬gE抗体效价检测：检测结果大于32时抗体水