水貂阿留申病乳胶凝集试验抗体检测方法的建立及应用

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1、：Ｓ８５８．９２０１８３分类号单位代码：１研究生学号：２０１５８５４０１０密级：公开吉林大学硕士学位论文专业学位（）水貂阿留申病乳胶凝集试验抗体检测方法的建立及应用ＰｒｅｐａｒａｔｉｏｎａｎｄＡｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｏｆＬａｔｅｘＡｌｕｔｉｎａｔｉｏｎｔｅｓｔｆｏｒＤｅｔｅｃｔｉｏｎｇｇｏｏｆＡｎｔｉｂｏｄａａｉｎｓｔＡｌｅｕｔｉａｎＭｉｎｋＤｉｓｅａｓｅｙｇ作者姓名：孙殿钢类别：兽医硕士领域‘（方向）：兽医指导教师：雷连成教授培养单位：动物医学学院２０１８年

2、０６月水貂阿留申病乳胶凝集试验抗体检测方法的建立及应用PreparationandApplicationofLatexAgglutinationtestforDetectionofAntibodyagainstAleutianMinkDisease作者姓名：孙殿钢领域（方向）：兽医指导教师：雷连成教授类别：兽医硕士答辩日期：2018年6月2日未经本论文作者的书面授权，依法收存和保管本论文书面版本、电子版本的任何单位和个人，均不得对本论文的全部或部分内容进行任何形式的复制、修改、发行、出租、改编等有碍作者著作权的商业性

3、使用（但纯学术性使用不在此限）。否则，应承担侵权的法律责任。吉林大学硕士学位论文原创性声明本人郑重声明：所呈交学位论文，是本人在指导教师的指导下，独立进行研宄工作所取得的成果Ｄ除文中已经注明引用的内容外，本论文不包含任何其他个人或集体已经发表或撰写过的作品成果。对本文的研宄做出重要贡献的个人和集体，均己在文中以明确方式标明。本人完全意识到本声明的法律结果由本人承担。如Ｍ学位论文作者签名：★日期：山Ｗ年６月／日丨中文摘要水貂阿留申病乳胶凝集试验抗体检测方法的建立及应用水貂阿留申病（Aleuti

4、andiseaseofmink,AD），由阿留申病毒（Aleutiandiseasevirus,ADV）引起的进行性传染病。该病不仅能够导致貂群的繁殖能力下降，而且还能引起成年水貂消瘦、皮张质量降低等问题，使特种养殖行业承受了巨大的经济损失，严重阻碍了我国毛皮行业的健康发展。目前公认的办法是通过检测来逐步淘汰病貂、弱貂，以达到净化貂群的作用。ADV特异性抗体检测是诊断该病的最有效途径，对流免疫电泳技术（Convectionimmuneelectrophoresis,CIEP）是ADV血清抗体检测方法之一，但该方法操作过程比较繁琐，检

5、测时间相对较长，加之需要特定仪器设备，在临床应用上受到了一定的阻碍。因此，建立一种准确率高、省时高效的水貂阿留申病检测方法势在必行。本研究将实验室前期设计并串联表达的水貂阿留申病毒抗原表位（简称抗原肽-SD）与羧基化聚苯乙烯微球共价偶联，制备抗原肽-SD微球复合物，建立了检测水貂阿留申病血清中特异性抗体的乳胶微球凝集试验方法。结果表明，制备抗原肽-SD微球复合物的最佳条件为：羧基化聚苯乙烯微球以EDC为活化剂、活化时间为15min、pH7.5MES缓冲液反应体系、偶联时间为30min，蛋白浓度为0.4mg/ml。制备的抗原肽-SD微

6、球复合物为检测抗原，建立的水貂阿留申病乳胶凝集试验抗体检测操作方法为：分别将被检血清和标准阴、阳性血清稀释2倍，滴加20l于载玻片上，同时做平行对照；将20l抗原肽-SD微球复合物滴加到待检血清和标准阴、阳性血清对照上，混匀后静置30s~60s观察结果。结果表明，该复合物可与ADV阳性血清出现较强的凝集反应，与伪狂犬病毒、犬瘟热病毒和水貂肠炎病毒等阳性血清均无凝集反应，具有良好的特异性。在1:32稀释的阳性血清与抗原肽-SD复合物仍能产生微弱的凝集反应，表明该方法具有良好的敏感性；该复合物与ADV阴性血清、蒸馏水、MES缓冲液、

7、PBS等无凝集反应，不发生自凝现象。I根据本试验所建立的方法，初步研制了便于现场检测ADV抗体的乳胶微球凝集试剂盒，与CIEP同步检测本实验室保存的404份水貂血清样品，结果表明，二者的符合率为89.6%。2017年10月，用该试剂盒在打皮期间对大连市瓦房店市的三家水貂养殖场（A场、B场、C场）的373份血清进行检测。结果表明，三个场的总阳性感染率分别为：67.85%、66.93%和66.42%。随后，又对该试剂盒进行了中间试制，结果表明，该试剂盒在特异性、敏感性和重复性上表现均良好。综上所述，本研究建立的抗原肽-SD微球凝集方法以

8、及组装的试剂盒，检测时间短，敏感性和特异性均良好，与CIEP的符合率较高，检测结果不需要复杂处理，为基层貂群提供了一种快速诊断方法，值得推广，也可为更好地预防和控制AD提供技术保障。关键词：水貂阿留申病，微球，凝集试验，抗体检测，血清