细胞破碎18020

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1、几种由大肠杆菌表达的胞内重组药物药物名称宿主用途胰岛素大肠杆菌治疗糖尿病人生长激素（HGH）大肠杆菌治疗侏儒病α-干扰素大肠杆菌治疗毛状细胞白血病和卡波济肉瘤细胞破碎概述细胞破碎（cellrupture）技术:利用外力破坏细胞膜和细胞壁，使细胞内容物包括目的产物成分释放出来的技术。细菌细胞壁G+菌：20～80nm的肽聚糖层G-菌:脂类含量较高破碎细菌细胞的主要阻力肽聚糖网状结构的致密程度和强度取决于聚糖链上所存在的肽键的数量和其交联的程度酵母细胞壁破碎酵母细胞的阻力葡聚糖交联的紧密程度和它的厚度霉菌细胞壁葡聚糖网状结构的交联度几丁质或纤维素的纤维状结构破碎霉菌细胞的

2、阻力植物细胞壁的化学组成和结构已生长结束的植物细胞壁：初生壁，次生壁植物细胞初生壁的化学组成组分结构和分类纤维素β－1，4－D－葡聚糖半纤维素木葡聚糖甘露聚糖木聚糖(包括阿拉伯木聚糖和4-0-甲基-葡萄糖醛酸木聚糖）果胶物质半乳糖醛酸聚糖、鼠李半乳糖醛酸聚糖半乳聚糖和阿拉伯半乳聚糖蛋白质结构蛋白各种酶类凝集素一、机械法高压匀浆破碎法（homogenization）高速搅拌珠研磨破碎法（finegrinding）超声波破碎法（ultrasonication）1.高压匀浆器（Highpressurehomogenizer）操作原理在高压下迫使细胞浆液在排出阀的小孔中高速

3、冲出，并射向撞击环上，使细胞受到高的液相剪切力而破碎。操作方式：单次或多次循环出口温度：20℃左右压力：55－70Mpa适用范围酵母和大多数细菌细胞的破碎。料液细胞浓度：20%左右。☆团状和丝状菌，不宜使用。注意事项（1）操作温度：↑２－３℃/10MPa（2）对料液作冷却处理。（3）多组破碎操作中需要在级间设置冷却装置可有效防止温度上升，保护产物活性。2.珠磨机研磨：将细胞悬浮液与玻璃小珠、石英砂或氧化铝等研磨剂一起快速搅拌，使细胞获得破碎。工作原理细胞的破碎是由剪切力层之间的碰撞和磨料的滚动而引起。磨室配有冷却夹套3.超声波破碎利用超声波振荡器发射的15-25kH

4、z的超声波处理细胞悬浮液。超声波振荡器的组成：发生器和换能器，机理在超声波作用下液体发生空化作用（cavitation),空穴的形成、增大和闭合产生极大的冲击波和剪切力，使细胞破碎。破碎效率与细胞种类、浓度和超声波的声频、声能有关。适用范围很强烈的破碎方法，适用于多数微生物的破碎。对冷却的要求苛刻，不易放大，用于实验室规模的细胞破碎。二、非机械法⑴酶解⑵渗透压冲击⑶冻结和融化⑷干燥法⑸化学法溶胞1.酶解（酶溶法Enymaticlysis)利用溶解细胞壁的酶处理菌体细胞，使细胞壁受到部分或完全破坏后，再利用渗透压冲击等方法破坏细胞膜，进一步增大胞内产物的通透性。特点条

5、件温和选择性地释放产物胞内核酸等泄出量少，细胞外形较完整，便于后步分离等价格高2.渗透压冲击法较温和高渗溶液→快速稀释，引起细胞快速膨胀破裂。3.冻结-融化法将细胞放在低温下冷冻（约-15℃），然后在室温中融化，反复多次而达到破壁作用。适用于细胞壁较脆弱的菌体。4.化学法采用化学法处理可以溶解细胞或抽提胞内组分。常用酸、碱、表面活性剂和有机溶剂等三、目标产物的选择性释放选择性释放目标产物，尽量少地释放其它物质，并且尽量降低细胞的破碎程度。一般原则⑴仅破坏或破碎存在目标产物的位置周围细胞膜附近：酶溶法、渗透压冲击法和冻结－融化法等。细胞质内：机械破碎法．（2）选择性溶

6、解目标产物四、包含体的分离和蛋白质复性很多利用大肠杆菌为宿主细胞的外源基因表达产物（如尿激酶、人胰岛素、人生长激素、白细胞介素－６、人γ－干扰素等）在细胞内凝聚成没有生物活性的固体颗粒－包涵体。（inclusionbodiesIBs)蛋白0产物占菌体总蛋白/%外源蛋白的积累人胰岛素50%形成包涵体γ-人体干扰素25%形成包涵体凝乳酶原形成包涵体牛生长激素>30%形成包涵体人胰岛素原5%~26%形成包涵体包含体的构成大多是基因表达产物，无定形的蛋白质的聚集。一级结构正确，但立体结构错误，无生物活性。基因工程包含体的纯化方法收集菌体细胞细胞破碎包涵体的洗涤目标蛋白的变性

7、溶解目标蛋白的复性目标蛋白的复性包涵体难溶于水，在变性剂溶液（如盐酸胍、脲）中才能溶解。在这些溶液中，蛋白质所有的氢键、疏水键全被破坏，但一级结构不被破坏。当除去变性剂时，一部分蛋白质可以自动折叠成具有活性的正确构型，这一折叠过程称为蛋白质的复性。路线（一）机械破碎(高压匀浆、高速珠磨）离心提取出包含体加变性剂溶解除变性剂复性路线1的特点特点:用离心法将包含体与细胞碎片和可溶性蛋白质分开缺点:要经过几次离心才能除去大部分的细胞碎片，加工时间较长。路线（二）机械破碎膜分离除可溶性蛋白加变性剂溶解包含体除变性剂复性路线2的特点用微孔膜除去可溶性蛋白质，但细胞碎片却和