蛋白质的分离与纯化课件

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1、第一章蛋白质的分离与纯化蛋白质分离纯化的一般原则（掌握）分配层析的基本理论（重点掌握）蛋白质的层析分离技术离子交换层析、凝胶过滤层析、亲和层析等主要掌握操作要点及操作过程的注意事项蛋白质的电泳分离技术不连续系统原理（重点掌握）SDS-PAGE技术（重点掌握）、IEF（一般了解）蛋白质的浓缩（了解）第一节蛋白质分离纯化的一般原则根据实验目的选择合适的材料，应遵循：目的蛋白含量及生物活性尽可能高材料来源方便、成本低、易操作可溶性及稳定性要尽可能好材料的选择注意：不同的生物体、不同生理状态、不同组织细胞的蛋白质含量和分布有很大差异预处理：将不必要的结缔组织

2、、脂肪组织等在尽可能接近生命状态下剔除，处理后应立即使用或在冷库中保存细胞的破碎先要将细胞和组织破碎，使蛋白质充分释放出来机械法匀浆：破碎机体软组织最常用方法之一组织捣碎：注意维持低温环境研磨：破碎单一细胞的有效方法，主要用于细菌、酵母等的破碎物理法超声法：输入高能超声波可以破碎细胞，破碎效率取决于声频、声能、处理时间、细胞浓度及细胞类型等在处理少量样品时操作简便、效率高，液量损失少，适于实验室使用注意:超声波产生自由基团和造成的溶液温度升高，可造成敏感的活性物质变性失活，另外噪声也比较大反复冻融法：由于在此过程中易使活性蛋白失活，故适用于提取非常稳

3、定的蛋白质冷热交替法：绝大多数细胞被破坏，一般适用于从细菌或病毒中提取蛋白质低渗裂解：是指无胞壁细胞在低渗溶液中通过渗透张力作用裂解的方法，常用于红细胞的裂解化学法有机溶剂法：有些有机溶剂(如苯、甲苯等)可以改变细胞壁或膜的通透性，使内含物有选择性的渗透出来表面活性剂(去垢剂)：常用的有十二烷基磺酸钠、TritonX-100、去氧胆酸钠等酶解法：必须根据细胞的结构和化学组成选择适当的酶特异、快速、精确、可重复、经济总蛋白含量蛋白质比活性（specificactivity）得率利用溶解度的差异分离盐析法：最经典的方法，常用来进行粗分离常用中性盐，主要有

4、硫酸铵、硫酸镁、硫酸钠、氯化钠等，其中应用最广的是硫酸铵影响盐析的因素很多，如pH、温度、蛋白质浓度等都会影响各种蛋白质的盐析点盐析硫酸铵沉淀有机溶剂沉淀法：有机溶剂能降低溶液的介电常数，从而减少氨基酸侧链基团的解离，降低蛋白质分子表面电荷，使蛋白质分子聚集导致溶解度的降低；另外有机溶剂与水的作用，能破坏蛋白质的水化膜，使蛋白质在一定浓度的有机溶剂中沉淀析出温度：在一定温度范围内(0～40℃之间)，大部分球状蛋白质的溶解度随温度升高而增加等电点法：当蛋白质处于等电点pH时，蛋白质的净电荷为零，由于相邻蛋白质分子之间没有静电斥力而趋于凝集(aggreg

5、ation)和沉淀(precipitation)，它的溶解度达到最低等电点沉淀根据分子量的不同分离透析(dialysis)和超滤(ultrafiltration)：是利用蛋白质分子不能通过半透膜的性质，使蛋白质和其它小分子物质如无机盐、单糖、水等分开平衡离心法：根据蛋白质分子大小、形状不同进行分离的技术凝胶过滤(gelfiltration)：又称分子筛层析(molecularsievechromatography)，这是根据分子大小分离蛋白质混合物的最有效方法之一透析过程根据电荷的不同分离电泳区带电泳：如醋酸纤维薄膜电泳，PAGE等等电聚焦(isoe

6、lectricfocusing,IEF)：具有更高分辨率的电泳技术毛细管电泳(capillaryelectrophoresis,CE)：在细孔管或毛细管中进行电泳分离。柱效高、分析时间短，所用样品量及试剂消耗少，操作模式多，可以进行在线检测和自动化Agilent3DCE毛细管电泳系统离子交换层析亲和层析亲和层析法可在温和条件下操作，纯化过程简单、快速、分辨率高，对分离含量少且性质不稳定的生物活性物质极为有效注意：应该尽量减少纯化步骤，缩短操作时间目的：避免目的蛋白的变性，保证其生物活性缓冲液(buffer)盐、金属离子和螯合剂还原剂去垢剂(deter

7、gent)蛋白酶抑制剂蛋白质的环境因素第二节层析的基本理论1906年M.TswettAdsorptionChromatography1941年MartinandSyngePartitionChromatographyPlatetheoryRatetheory假设有两种互不混溶的溶剂S和M，将A物质溶于一定量的S溶剂中，再加入一定量的M溶剂A物质在两相中相互扩散A物质在两相中达到了平衡(在同一时间内，进出两相的A物质的分子数完全相等)时，其分配系数为常数一、分配定律CAS分配定律表明：一定的条件下，一定的物质其K值不变条件改变其K值随之改变K值大于1，

8、物质在S相中的浓度大于其在M相中浓度CAM=K二、分配层析的机理假设有两种物质，在一定的条件下，它们的分配系