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1、动物细胞论文班级:生物零九二姓名:段翔学号:13509224WAVETM生物反应器中的Cytodex™微载体细胞培养工艺摘要WAVEBioreactor系统多用于悬浮细胞的培养。然而，用于细胞治疗和疫苗生产的多种细胞为贴壁依赖型的，需要一个可贴附的生长表面。在本研究中，Cytodex微载体被应用在CelIbagTM生物反应器中以扩增Madine~DarbyCanineKidney(MDCK)和Vero细胞。为了优化细胞贴附，测试了两种细胞株的不同摇动混合条件。我们发现培养基成分对细胞贴附有显著的影响；例如在低血清培养基中的
2、MDCK和Vcro细胞，用间歇式和连续摇动混合都可以使细胞贴附到微载体上。然而，在无血清条件下，Vcro细胞在间歇式摇动混合下可以获得高贴壁率。生长在WAVEBioreactor系统中的MDCK细胞可以被放大到2L和10LX作体积。细胞达到最大密度为3X106细胞/ml。Vero细胞在2L工作体积下的Cytodex1和Cytodex3微载体上培养，无血清条件下达到1.4X106纟田胞/ml最大密度。用转瓶同样条件可以获得相同密度的Vero细胞，WAVE中细胞生长速度更快。数据显示WAVEBiorcactor系统是成功用于M
3、DCK和Vero细胞微载体培养的通用平台，可以方便的进行规模放大，是对传统搅拌罐生物反应器或转瓶的一种快速和方便的替代系统。介绍与滚瓶(RollerBottle)中的细胞培养不同，贴壁细胞在微载体上的培养使它相对容易进行生产工艺的规模放大。此外，微载体使细胞能够在生物反应器中扩增，与多个小T型瓶等塑料培养容器相比，生物反应器可以提供更好的工艺参数自动控制，降低劳动强度的同时减少污染的危险。一次性生物反应器的使用减少了投资成本、提高灵活性（简化批次间的轮换准备等操作）,消除了生产容器清洗验证的需要。WAVEBioreacto
4、r系统是设计用于人、动物、植物和昆虫细胞培养的一次性发酵设备，并可以用于细菌和真菌的培养。WAVEBioreactor系统不需要清洗或灭菌，这减少了生物制药生产中工艺验证的需要。尽管WAVEBioreactor系统多用于悬浮细胞的培养，本文的研究表明WAVE反应器也适合微载体上贴壁细胞的培养。本文描述了MDCK和Vero细胞在WAVEBioreactor系统中Cytodex微载体上的培养。我们对微载体培养所必需的参数如最佳摇动混合条件和工作体积范围、细胞贴附效率、最大细胞密度以及从2L工作体积放大到10L的可行性进行了深入
5、研究。使用细胞特异性的参数如贴附、生长速率和最大细胞密度等，对WAVEBioreactor系统和转瓶培养进行了比较和评价。WAVEBioreactor系统中贴壁细胞培养的一般操作程序如图1所示。榊毒曲染眄,TOLTOH』下游处理>收获图1.WAVEBioreactor系统中微载体培养工艺流程图—:细胞培养设备，材料•培养液1.仪器,器皿：(1)倒置相差显微镜⑵C02培养箱⑶电热干燥箱⑷水纯化装置⑸冰箱:普通冰箱(培养液，生理盐水,Hankes液，短期保存的组织标本)和・209冰箱(保持生物活性及较长时间存放的制剂如酶，血清
6、等)(6)液氮容器:储存细胞(7)离心M(4000rpm,1000rpm即可及天平(8)高压蒸气消毒气⑼滤器:Zeiss滤器，玻璃滤器,微孔滤器等。(一次性滤器：12.00x10)(10)消毒培养液，(11)血清(12)消化用胰酶等。(13)在常规培养中，MDCK细胞生长在T型瓶和多层细胞工厂(CorningLifeSciences,SigmaAldrich)中用于接种准备。：(14)培养瓶:250mL100ml(4.50x20),25ml(3.50x10)(15)培养皿:10cm,9cm(3.50x10),6cm(2.5
7、0x10),3.5cm(16)多孔培养板：96孔(16.50x1),24孔(16.50x3),12孔，6孔，4孔(17)玻璃瓶:1000ml,500ml,250ml,100ml,50ml,25ml,5ml(10)吸管：刻度吸管(吸取，转移液体：lml,2ml,5ml,10ml)(3.00x10)直头吸管(吸取，转移液体)弯头尖吸管(吹打，混匀，传代细胞)(19)加样器：微量加样器用于吸取，移动液体，滴加样品(20)其他用品：铝饭盒，橡皮吸头，胶塞，注射器，烧杯，量筒，漏斗2:培养液⑴细胞培养在含有2%FBS(CII3016
8、0.03,H^^Clone)UltraMDCK(12-749Q,Lonza)培养基中3:材料(1)微载体Cytodex(2)染色溶液(3)细胞培养-MDCK细胞(4)细胞培养-Vero细胞二:工作参数：pH:精度±0.01pHDO:精度±2%温度：精度±0.1°C转速：精度±lrpm数据采集：多路数据采
