基因型鉴定 中科院版

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1、1.鼠尾DNA提取第一天：1.剪取小鼠尾尖（同样适用于脚趾，胚胎组织，卵黄膜等，若不立即提取，可以放置4℃数日）放入1.5mlEP管。2.每管加入鼠尾裂解液350ul+10ul蛋白酶K（简称PK，10mg/ml，现用现加）。3.55℃水浴消化过夜第二天：4.用劲将消化好的组织摇匀（可用振荡器摇匀）。5.每管加入350ul酚/氯仿（苯酚：氯仿：异戊醇25:24:1，事先配好，4℃保存）。6.上下充分混匀，室温静置3分钟后，离心，12000转，30分钟。7.取出离心后的EP管，可见液体分为三层，取上层无色水相液体约200μl于新1.5mlE

2、P管中，注意勿吸取中层液体。（不能将中间的蛋白层吸起来，否则会对后续的实验造成影响。为防止压力过大，可使用切去尖端的枪头）。8.向新EP管中加入400μl无水乙醇（为2倍于上清的体积），上下颠倒混匀，此时应可看到白色丝状样的DNA。9.离心12000转，10分钟。10.可看到有白色沉淀，弃去上清，加入1ml的75%乙醇，将沉淀弹起，以便去除DNA上过多的离子。11.离心，12000转，10分钟。12.弃去上清，倒置EP管于吸水纸上，室温干燥约15分钟（注意不能过分干燥，以免基因组DNA难溶解）。13.加入150-200μl(根据DNA沉

3、淀的量)无菌蒸馏水或者是TEBuffer，可放置37℃助溶。14.短期4℃，长期-20℃保存。相关配方：1.鼠尾裂解液配方1000ml溶解液中含：100mMTris-HClpH8.55mMEDTA0.2%SDS200mMNaCl室温保存。2.蛋白酶K溶液：取100mg蛋白酶K，加去离子水10ml使成10mg/ml，分装后冻存于-20℃，用时溶解。3.酚/氯仿：取Tris平衡酚50ml，氯仿48ml，异戊醇2ml加入100ml棕色试剂瓶中混匀，4℃避光保存。1.基因鉴定PCR反应标准的PCR反应体系：　　　　　10×扩增缓冲液　10ul　

4、4种dNTP混合物　各200umol/L　　引物　　　　　各10～100pmol　　　　模板DNA　　　　0.1～2ug　　　　TaqDNA聚合酶　2.5U　　　　Mg2+　　　　　　1.5mmol/L　　　加双或三蒸水至　100ul以我们实验室常用的PCR25ul体系为例：10xbuffer：2.5uldNTP2ulMgCl2：1.5ulPrimerF：1ulPrimerR：1ulTaq酶：0.5ulDNA模板：1~3ul去离子水加至：25ul退火温度根据引物合成说明书决定PCR操作注意事项：1)PCR的复合管配制需在冰上进行，尤其t

5、aq酶需始终放于冰上，或者在最后加入时从-20°冰箱拿出，加完后立即放回。2)PCR反应极为灵敏，操作过程应当注意避免样本之间的相互污染，吸取不同样本时应当换枪头。1.琼脂糖凝胶电泳1.根据欲分离DNA片断大小用凝胶缓冲液（TAE缓冲液）配制适宜浓度的琼脂糖凝胶，以1%胶为例：称取琼脂糖1克，倒入通风橱内的锥形瓶中，尽量不要让粉末沾在内壁上。用量筒量取1×TAE100ml，倒入锥形瓶，戴入一次性手套混匀。2.戴一次性手套把锥形瓶放入微波炉，加热3min左右，使琼脂糖彻底溶解，看不到颗粒为止。在此期间插好制胶的板槽和梳子。3.迅速将锥形瓶

6、置于通风橱内，冷却片刻，用通风橱内20μl枪，吸6~10ul（0.05%）的EB，插入液面，轻轻旋转以充分混匀凝胶溶液，倒入电泳槽中，注意避免产生气泡，如有气泡，应设法除去。（枪头应丢入指定垃圾箱）4.等待30min冷却。5.凝固后，戴一次性手套，先两端起开一点梳子，再将梳子完全拔出，将胶安放在电泳槽内。6.向电泳槽中倒入电泳缓冲液，其量以没过胶面1mm为宜，如样品孔内有气泡，应设法除去。退掉一次性手套加样。7.每个25ul样本加入6×buffer5ul，混匀后，将样品缓冲液缓慢加入被浸没的凝胶加样孔内。8.加样后。带上一次性手套接通电

7、源，插上+/-极，切记DNA样品由负极往正极泳动。设置电压，一般为60-100V，按下RUN开始电泳，电泳15-30分钟即可。9.根据指示剂泳动的位置，判断是否终止电泳；一般前端染料到2/3处即可。10.电泳完毕后，戴一次性手套关掉电泳仪。拿出胶版，推出胶。在凝胶成像仪上观察电泳带及其位置，并与核酸分子量标准Marker比较被扩增产物的大小。