分子标记-杨龙

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1、木薯SRAP扩增体系的建立与优化作物遗传育种杨龙分子标记技术研究背景材料与方法分析讨论研究背景：SRAP是一种新型的基于PCR的标记系统，由Li与Quiros（2001）提出，又叫基于序列扩增多态性(sequencebasedamplifiedpolymorphism，SBAP)。该标记通过独特的引物设计，达到对ORFs（openreadingframes）进行扩增的目的。SRAP是近年来发展起来的一种新型分子标记系统，它具有简便、中等产量、高共显性、重复性、易于分离条带及测序等优点。SRAP标记中，引物的设计是关键，它是基于2个引物的扩增，上游引物长17bp，对外显子进行特异扩

2、增，下游引物长18bp，特异扩增的是内含子及启动子区域由于个体不同以及物种之间的内含子、启动子之间间隔长度不同而产生多态性。2个引物均由5‘端14~15bp的核心序列，和3’端3个选择性碱基组成，其中核心序列又10~11bp的无特异性的填充序列以及CCGG（正向引物中），或AATT（反向引物中）组成。且正向和反向引物中的填充序列必须不同。扩增的过程采用复性变温法，前5个循环复性温度为35℃，后30~35个循环则为50℃，扩增后的DNA片段可用聚丙烯酰胺或琼脂糖凝胶电泳分离，EB、银染或放射自显影检测。SRAP标记最早是在芸薹属作物中开发利用，目前已在花生、黄瓜、辣椒、小麦、甘薯、

3、棉花、西瓜、油菜等植物中使用，应用于植物种质资源鉴定评价、种缘进化关系、遗传图谱构建、基因定位、重要性状标记以及比较基因组学方面。实验材料实验试剂分析讨论实验方法1.试验时间、地点：试验于2007年10月在中国热带农业科学院，热带生物技术研究所进行。2.试验材料及试剂：试验材料为木薯华南六号（SC6）和面包木薯（MB）杂交一代的自交F2群体，由热带生物技术研究所分子育种组提供。CTAB法提取DNA。实验材料1.SRAP引物由上海生工合成，32对正向引物和21对反向引物。2.所需PCR试剂：Taq酶、dNTP、10xPCRbuffer为申能博彩产品，DNAMarkerDL2000，

4、琼脂糖购自TIANGEN公司。实验试剂1.根据Li和Quiros应用于蔬菜上的反应扩增程序：94℃，预变性5min，然后，先按94℃变性1min，35℃退火1min，72℃延伸1min的顺序，进行5个循环，然后将退火温度升至50℃，其它温度仍然不变，再进行35个循环；最后，72℃再延伸5min。2.本试验在此程序基础上用PCR方法分析DNA、aqDNA聚合酶、dNTPMixture、primer的浓度及变性温度、复性温度、延伸时间和循环数对扩增结果的影响。3.扩增产物采用2%的Metaphor琼脂胶进行平板电泳，胶中加入0.3μg/ml溴化乙锭(EB)，梳子厚度1mm。取9μl样

5、品点样，用0.5倍TBE缓冲液，在100V电压下电泳2h，用凝胶成像系统进行结果显示。实验方法结果分析DNA浓度的确立1.在10μl体系中利用引物me12和em6进行SRAP扩增。2.结果表明（图1）：10~80ng模板扩增的SRAP产物几乎完全一致，没有明显的差异，SRAP产物基本保持不变，这与在其他作物上的研究结果基本一致。又这说明SRAP扩增对模板DNA的浓度范围可以较宽。通过比较，选用30ng为最佳模板量。3.模板DNA对PCR结果有很重要作用，模板DNA用量过少，会减少引物与模板DNA结合的机率，降低扩增效率，导致扩增的产物量少，检测时条带淡或无条带；用量过大，会增加非

6、特异性条带，另外也会增加模板DNA之间配对的机会。结果分析TaqDNA聚合酶用量确定1.本试验在10μl体系中分别设定TaqDNA聚合酶（5U/μl）4个浓度梯度为0.1μl、0.2μl、0.3μl、0.4μl。扩增结果经琼脂糖电泳检测结果表明，TaqDNA聚合酶使用0.1μl时条带较暗，TaqDNA聚合酶为0.2μl、0.3μl、0.4μl时条带明亮、清晰（图2）为节省起见，所以本研究确定使用10μl体系中TaqDNA聚合酶为0.2μl。2.TaqDNA聚合酶的用量过大会造成浪费，并且会导致非特异性扩增；用量过小，会影响扩增效率，降低扩增产物的产量。结果分析引物浓度的确定本试验

7、在10μl体系中分别设定引物（50ng/L）6个浓度梯度为0.1μl、0.3μl、0.5μl、0.7μl、0.9μl、1.1μl。扩增结果经琼脂糖电泳检测结果表明，引物使用0.1μl时条带不全，引物为0.3μl、0.5μl时条带明亮、清晰，引物使用0.9μl、1.1μl时有二聚体的形成（图3）。所以本研究确定使用10μl体系中引物为0.3μl。引物用量少，与模板DNA结合效率低，产物的产量就会受到影响。引物用量过大，也有不利影响；会增加非特异性结合的机率，也会增加引物之间形成引物