无菌检查、微生物限度检查+方法学验证实例

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1、无菌检查、微生物限度检查方法学验证实例9/15/20211虎杖苷注射液无菌检查的方法验证样品：虎杖苷注射液由深圳海王药业有限公司提供，批号20040305。培养基：无菌检查用硫乙醇酸盐液体培养基，批号040203；霉菌液体培养基，批号040302；营养肉汤培养基，批号0403045；营养琼脂培养基，批号040513；0.1%蛋白胨溶液，批号050217；虎红钠琼脂培养基，批号040202；由中检所所培养基室提供。9/15/20212方法：中国药典2005版无菌检查中薄膜过滤法方法验证验证试验用菌种：验证试验用菌

2、种包括金黄色葡萄球菌（26003）、铜绿假单胞菌（10104）、枯草芽孢杆菌（63501）、生孢梭菌（64941）、白色念珠菌（98001）、黑曲霉菌（98003），来自中国医学细菌保藏中心。9/15/20213菌液制备：取经34℃培养18～24小时的金黄色葡萄球菌、绿脓假单胞菌与枯草芽孢杆菌肉汤液体培养物1ml加入9ml0.9%氯化钠溶液中，10倍稀释至10－5～10－7约为50～100cfu/ml备用。取经24℃培养18～24小时的白色念珠菌液体培养物1ml，加入9ml0.9%氯化钠溶液中，10倍稀释至10－5

3、约为50～100cfu/ml备用。9/15/20214取经34℃培养18～24小时的生孢梭菌硫乙醇酸盐液体培养物1ml，加入9ml0.9%氯化钠溶液中，10倍稀释至10－7备用。取经培养一周的黑曲霉斜面培养物，加0.9%氯化钠溶液3ml，洗下孢子，转移至另一空管，标准比浊管比浊后，取1ml加入9ml0.9%氯化钠溶液中10倍稀释至10－4约为50～100cfu/ml备用。9/15/20215供试液制备：取样品10瓶分别加0.1%蛋白胨溶液30ml溶解后，过滤。7.活菌计数活菌计数结果见表1。9/15/2021610

4、－4稀释10－5稀释10－7稀释试验次数121212金黄色葡萄球菌5660枯草芽孢杆菌7779白色念珠菌8670黑曲霉菌8076铜绿假单胞菌47509/15/20217方法验证直接接种法：取样品12支，分别接种8支硫乙醇酸盐和4支霉菌液体培养基2ml/支后，再按要求加入相应的阳性菌液（30-100个/ml），置规定温度培养3-5天，逐日观察结果。9/15/20218薄膜过滤法：取样品11支，将样品过滤于封闭式滤器（3联筒/套），用0.1%蛋白胨氯化钠溶液冲洗500ml后，再分别人工污染金黄色葡萄球菌、枯草杆菌50~

5、100个/筒即可，同时平行做稀释剂的对照组。将稀释剂对照滤筒和污染阳性菌的验证滤筒置37℃培养3～5d，逐日观察，结果见表2、3、4。9/15/202199/15/2021109/15/2021119/15/202112结论：根据上述结果，由于采用直接接种法进行虎杖苷注射液的无菌检查，存在对金黄色葡萄球菌和枯草杆菌生长的抑制作用。因此，虎杖苷注射液的无菌检查应依据中国药典无菌检查方法中的薄膜过滤法进行，冲洗量规定为500ml。9/15/202113头孢噻肟钠无菌原料的无菌实验方法验证样品：头孢噻肟钠无菌原料，规格：

6、0.5g/瓶；批号：40807001；生产单位：AventisPharmaDeutschlandGmbH培养基：硫乙醇酸盐流体培养基、真菌培养基、营养肉汤、普通斜面、真菌斜面、营养琼脂、虎红琼脂(均由中国药品生物制品检定所培养基室提供)β-内酰胺酶：2ml大于300单位/毫升（批号：20030630）9/15/202114验证试验用菌种：（1）金黄色葡萄球菌(Staphylococcusaureus)[CMCC(B)26003]；(2)枯草芽孢杆菌（Bacillussubtilis）[CMCC(B)63501]；(

7、3)大肠埃希菌（Escherichiacoli）[CMCC(B)44102]；(4)铜绿假单胞菌(Pseudomonasaeruginosa)[CMCC(B)10104]；（5)生孢梭菌(Clostridiumsporogenes)[CMCC(B)64941]；(6)白色念珠菌(Candidaalbicans)[CMCC(F)98001]；(7)黑曲霉(Aspergillusniger)[CMCC(F)98003]。9/15/202115仪器和滤器：HTY-2000A集菌仪，全封闭无菌试验过滤培养器（批号20050

8、105）北京牛牛基因有限公司。方法：中国药典2005年版无菌检查的验证实验9/15/202116操作方法菌液制备：取金黄色葡萄球菌、枯草芽孢杆菌、大肠埃希菌、铜绿假单胞菌的新鲜培养物少许接种至营养肉汤培养基中,生孢梭菌的新鲜培养物少许接种至硫乙醇酸盐流体培养基中,32.5±2.5℃培养18～24小时；9/15/202117取经32.5±2.5℃培养19~21