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《原生质体融合技术的方法与影响因素【文献综述】》由会员上传分享，免费在线阅读，更多相关内容在行业资料-天天文库。
1、毕业论文文献综述生物工程原生质体融合技术的方法与影响因素摘要：原生质体融合技术被广泛的应用于生物学、遗传学、医学免疫学、以及食品、农学等各个方面。此技术不仅能克服远源杂交产生的障碍，还能使不同的优秀基因导入同一细胞，更成为改良生物的有力工具。文章就原生质体制备、融合及其再生过程中的方法及影响因素做了综述。关键词：原生质体融合；影响因素；融合方法前言原生质体融合也称细胞杂交、细胞融合或体细胞杂交，是指细胞通过介导和培养，在离体条件下用人工的方法将不同种的细胞通过无性方式融合成一个核或多核的杂合细胞的过程[1]。原生质体融
2、合技术起源于20世纪50年代。自Weibull利用溶菌酶首次得到巨大芽孢杆菌的原生质体之后,Eddy等利用蜗牛酶获得酵母菌原生质体的报道也相继出现。70年代,Kao发现聚乙二醇(PEG)在钙离子(Ca2+)存在的条件下,能促使植物细胞的原生质体融合,并提高融合率;此后原生质体融合技术得到了快速的发展。20世纪80年代初,Zimmermann等报道了电诱导细胞融合的新技术,后来又发展了电磁融合法、激光融合法等技术,使原生质体融合技术在微生物育种方面形成一个系统的、成熟的实验体系。如今原生质体融合技术已成为工业菌株改良的重
3、要手段之一，并在农业、医药、环保等领域取得了开创性的研究成果，而且应用领域不断扩大[2]。微生物原生质体融合技术整个过程包括：原生质体的制备，原生质体融合，原生质体再生[2]。1原生质体的制备将单倍体细胞接种于液体完全培养基中活化,然后离心收集菌体,悬浮于乙二胺四乙酸(EDTA)或巯基乙醇中,振荡处理一段时间,使菌体细胞壁中的交联键松动,对酶的敏感性增加,再离心收集菌体,加入高渗酶液酶解,一般的高渗酶液配比为1%～2%蜗牛酶+17%的蔗糖或山梨醇。随着酶解时间的延长菌体去壁程度更加完全,表现为原生质体形成率逐渐上升,当
4、达到一定时间后,绝大多数的细胞已形成原生质体,再进行酶解会使原生质体的质膜受到损伤,造成原生质体的失活,使再生率下降,因此必须选择合适的酶解时间[3]。2原生质体的制备影响因素42.1培养基成分对原生质体制备的影响用酶分解微生物细胞壁，首先要培养菌体或菌丝体。菌体生长的培养基对原生质体化有明显影响，并且这种影响视微生物而异。原生质体化前在培养基中加入某些物质阻止细胞壁的合成，可以提高酶解的效果。2.2酶系和酶浓度对原生质体制备的影响利用酶分解细胞壁，由于各菌种细胞壁的成分和结构存在差异，因此不同的菌株所用酶的种类和浓度
5、都有很大差异。酶的种类、浓度是制备原生质体最关键的因素。2.3酶解时间对原生质体制备的影响酶解时间的长短直接影响原生质体化的效果处理时间过短，脱壁不完全；处理时间过长，会导致原生质体脱水皱缩，再生率显著降低。2.4温度对原生质体制备的影响不同的酶均有各自的最适酶解温度。酶解时温度选择的原则是既有利于原生质体化，又能防止原生质体被破坏。细菌的最适酶解温度一般为35～37oC或42oC，真菌的最适酶解温度为30～50oC，放线菌的最适酶解温度为28～37oC。2.5pH值对原生质体制备的影响酶解时的pH值随酶和菌种有一定的
6、差异，需根据实际情况对pH值进行优化。pH6.0对菌种S-37原生质体制备有利。而实验证明，pH4.5鲍菇的原生质体制备率最高[4]。3原生质体融合的方法3.1PEG结合高Ca2+诱导法聚乙二醇(PEG)是一种多聚化合物，不同种类微生物对PEG分子质量的要求不尽相同。放线菌适用分子质量常为1ku～1.5ku，也有人使用0.4ku～6ku，真菌一般采用4ku～6ku，细菌用1.5ku～6ku。亲本原生质体制备好后，即可进行融合。关于促融机制，一般认为PEG本身就是一种特殊的脱水剂，它以分子桥形式在相邻原生质体膜间起中介作
7、用，进而改变质膜的流动性能，降低原生质膜表面势能，使膜中的相嵌蛋白质颗粒凝聚，形成一层易于融合的无蛋白质颗粒的磷脂双分子层区。在Ca2+存在下，引起细胞膜表面的电子分布的改变，从而使接触处的质膜形成局部融合，出现凹陷，构成原生质桥，成为细胞间通道并逐渐扩大，直到两个原生质体全部融合[5]。3.2电融合法电融合技术是利用直流或交流电场的作用,迫使两亲本原生质体融合。包括下述过程；细胞在电场中极化成偶极子,沿电力线排列成串珠状；两极间的高压电脉冲击穿紧密接触的细胞质膜,在细胞膨压的作用下完成融合。其优点是:融合频率高,4对
8、细胞无化学毒害,可在显微镜下观察融合全过程;还具有空间定向、时间同步可调控的特点由于对设备的依赖程度较大,电激时间、电压梯度、交变频率等条件不易摸索,自80年代初发明以来,一直难以推广。在酵母菌原生质体融合中,汪和睦[6]、张博润[7]、程东升等[8]曾利用电融合法成功地进行了啤酒酵母的融合。3.3激光诱导融合法利用激光束对相邻两
