[精品]菌种鉴定

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1、细菌基因组的提取:1快速微量提収法A.取1.5ml菌体培养物于一灭菌Ep管中，12000rpm离心lmin,丢去上清夜，收集菌体。B.加入400ul裂解液(40mMTris■醋酸，20mM醋酸钠,lmMEDTA,l%SDS,pH7.8)混匀，置于37°C水浴lhr0C.然后加入200ul5mol/L的氯化钠溶液，混匀后于13000gm离心15min。D.取上清液，用苯酚抽提2次，氯仿抽提1次。E.加两倍体积无水乙醇，1/10体积酷酸钾(3M,pH8.0),・20度保存1小时后，13000rpm离心15min,弃上清液，沉淀

2、用70%乙醇洗2次;置于室温干燥后,溶于50ulTE溶液中,置4°C保存备用。2蛋口酶/SDS法制备先用10ml含适当抗生素的GBM过夜培养Delftiasp.,第二天4000rpm离心lOmin收集菌体，用WashingTE(50mmol/LTris-HClpH8.0,1Ommol/LEDTApH&0)洗菌体2次，Z后将菌体充分悬浮在5mllxTE缓冲液中，先后加入0.5ml5mg/L的蛋白酶、0.5ml10%SDS,轻轻混匀后50°C放置3h〜5h,接着用等体积的Tris饱和苯酚抽提2次,苯酚/氯仿/异戊醇抽提一次，氯

3、仿抽提一次后，乙醇沉淀DNA,用自动移液器吸管头将絮状DNA沉淀块吸附到Ep管中，70%乙醇洗2次，干燥后溶于适当lxTE或ddH20中。3⑴细菌培养：细菌接种于5ml液休培养基中，37°C摇床(300rpm)培养过液。⑵细菌收集：取lml培养物于1.5mlEP管中，室温SOOOrpm心5mim弃上清，沉淀重新悬浮于lmlTE(pH8.0)中(用ddH20也行)。⑶菌体裂解：加入6

4、il50mg/m1的溶菌酶，37°C作用2h。再加2mol/LNaC150pl,10%SDSllOpl,20mg/m1的蛋白酶K3pl,50°

5、C作用3h或37°C过後。(此时菌液应为透明粘稠液体)(4)抽提：菌液均分到两个1.5mlEP管，加等体积的酚：氯仿：界戊醇(25:24:1),混匀，室温放置5-10mino12000rpm离心lOmino抽提两次。(上清很粘稠，吸取时应小心，最好枪头尖应剪去)⑸沉淀：加0.6倍体积的异内醇，混匀，室温放置lOmino12000rpm离心lOmino(6)洗涤：沉淀用75%的乙醇洗涤。(7)抽(凉)干后，溶于50plddH2O中，収2・5山电泳。作PCR模板用。4DNAEXTRACTIONPROCEDURE・GENERAL

6、1)Growcellsovernightin500mlbrothmedium.2)Pelletcellsbycentrifugation,andresuspendin5ml50mMTris(pH8.0),50mMEDTA.3)Freezecellsuspensionat-20C4)Add0.5ml250mMTris(pH8.0),10mg/mllysozymetofrozensuspension,andletthawatroomtemperature・Whenthawed,placeonicefor45min.5)Add1

7、ml0.5%SDS,50mMTris(pH7.5),0.4MEDTA,1mg/mlproteinaseK.Placein50Cwaterbathfor60min.6)Extractwith6mlTris-cquilibratcdphenolandcentrifugeat10,000Xgfor15min.Transfertoplayertonewtube(avoidinterface).Re-dothisstepifnecessary.7)Add0.1vol3MNaacetate(mixgently),thenadd2vol

8、95%ethanol(mixbyinverting).SpooloutDNAandtransferto5ml50mMTris(pH7.5),1mMEDTA,200g/mlRNase.Dissolveovernightbyrockingat4C.8)Extractwithequalvolumechloroform(mixbyinverting)andcentrifugeat10,000Xgfor5min.Transfertoplayertoanewtube・9)Add0.1vol3MNaacetate(mixgently),

9、thenadd2vol95%ethanol(mixbyinverting).10)SpooloutDNAanddissolvein2ml50mMTris(pH7.5),1mMEDTA.11)CheckpurityofDNAbyelectrophoresisandspectrophotometricana