产灵菌红素菌株的分离鉴定

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1、产灵菌红素菌株的分离鉴定第卷第期湖北大学学报口然科学版?34Vol.34No.499••年月？？201212Jo??nalofII?beiUni?e??i?Na???alScienceDec.20121000-2375201204-0384-03产灵菌红素菌株的分离鉴定朱雄伟翟莉莉张楠苏腾甲武汉工程大学化工与制药学院绿色化工过程省部共建教育部重点实验室湖北武汉430074摘要？以从糖化车间中采集的样品为试验材料分离得到一种菌该菌株可产一种红色素红色素经过特性?全细胞脂肪酸组分进行研究?并通过测定其基因序列的方法来鉴定此菌

2、株结果表明？基因序列与粘质沙雷氏菌种的亲缘关16S?RNA16S9RNA系最接近?16S?RNA基因测序BLAST结果表明此菌株为粘质沙雷氏菌S?????????????????.99■99••??关键词?灵菌红素分离鉴定16S?RM粘质沙雷氏菌??中图分类号?Q936???文献标志码?A??灵菌红素p?odigio?in?PG是一类天然红色素的总称是一些放线菌沙雷菌及其他细菌的代谢产99999•••••物研究发现灵菌红索具有抗细菌抗真菌抗疟疾免疫抑制和抗肿瘤等生物活性因此受到人们的广99••泛关注1长期以来？灵菌红素

3、的研究主要侧重于其化学合成途径的探索及其潜在的临床应用？而对灵菌红素的生产研究较少随着生物操作技术的发展和对灵菌红素的深入研究?人们将更加清晰地认识灵菌红素的产生和作用机制？大量生产制备灵菌红素?用于替代在癌症及免疫治疗中对人体有害作用的化23学药物造福于人类本研究从糖化车间分离种菌株对其代谢产物进行分析发现菌株可产灵菌并对菌株形态和菌落特征生理生化特性全细胞脂肪酸组分进行研究并通过测定其16S7RNA99••基因序列的方法来鉴定此菌株4.1材料与方法91.1?材料1.1.1??由湖北省黄石市兴华生化有限公司糖化车间提供

4、・99••9999••••99••?????琼脂糖澳化乙锭上样缓冲液电泳缓冲液特异引物1.1.2??AEPCR?B?ffe?酶基因组提取试剂盒凝胶回收试剂盒牛肉膏蛋白dNTPmi?TaqA??P?epDNAA??P?epDNA月东？柠檬酸三钠？？琼脂粉？可溶性淀粉??仪？电泳仪？电热恒温鼓风干燥箱？高压蒸汽灭NaClCaClPCR菌锅？恒温培养箱？高速离心机？智能傅立叶红外光谱?美国的全自动鉴定系Ne???470FTIRMIDI99••???优化培养基白月东质量分数牛肉膏质量量分数2%分数1.1.3?质量分数质量分数10

5、%基础培养5%葡萄糖质量CaC120.156%pH5.0?6.52%NaCl0.5%1・2?方法2199999初筛培养制备初筛菌悬液称取土壤样品接种于高压灭菌的基础培养基屮lg・130?37?续培养30d进行富集得初筛菌悬液取初筛菌悬液20L涂布于固体基础培养基在初筛平板上挑取不同形态的单菌落在液体优化培养基中扩大培养?并进一步进行涂布分离?经多次纯化？分离?最后得到收稿日期201207199999999•••••••作者简介朱雄伟1973男博士讲师Email?h??l?163第期朱雄伟等?产灵菌红索菌株的分离鉴定99•

6、•不同菌落形态的纯平板？挑取纯平板的单菌落于基础培养基中？30?恒温培养过夜？得分离菌悬液5・99••复筛培养制备复筛菌悬液在一定浓度氯化钱基础培养基内加入初筛分离菌的分离菌悬液2999•••950L30?恒温振摇5?7d得复筛菌悬液取复筛菌悬液20L涂于固体优化培养基30?恒温培养?观察并记录细菌生长情况以及菌落形态?然后挑取单菌落在优化培养基小逐级加入一定梯次浓12d度的柠檬酸三钠？分离得到纯的此菌株•67-91.2.2???????????????发酵液离心后得到的菌体经过酸性甲醇萃取萃取液经浓999•••9缩去溶

7、剂用乙酸乙酯溶解低温静置沉淀后得到的混合物用去溶剂得到红色素粗产品？再利用薄层色谱和柱色谱法对其进行再分?得到红色索纯品・?89?1.2.3?????????????物质红外光谱的波长位置与吸收谱带的强度反映了其分子结构的特点结构不同的化合物具有不同的振动吸收频率由此可鉴定未知物的结构组成确定其化学基团红外条件？采用液膜法？红外光谱能量为?波数范围为-11.2.4????????????采用美国MIDI的全口动鉴定系统•99••1.2.5?????1提取细菌核DNAA??P?ep基因组DNA提取试剂盒基因的扩增？扩增引物

8、参照等人的方法合成？216S?DNAPCRPCRWei?b??g?正向引物P2反向引物5GGTTACCTTGTTACGACTT3.产物的凝胶电泳?将行电泳产物以琼脂糖凝胶进3PCRPCR1%产物凝胶回收凝胶冋收试剂盒4PCRDNA■测序？测序用正反向引物参照等人方法合成加入”模板516S7DNAPCRHi?ai?hi