转印膜的简单介绍

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1、印迹试验中转印膜的简单介绍Lola2015.5.20培训内容以蛋白质印迹试验为例了解印迹试验的基本原理转印膜在印迹试验中的作用如何根据实验目的，选择转印膜常见的印迹试验转印膜的优缺点WesternBlot由来印迹法（blotting）是指将样品转移到固相载体上，而后利用相应的探测反应来检测样品的一种方法。1975年，Southern将DNA转移到硝酸纤维素膜（NC膜）上，并利用DNA－RNA杂交检测特定的DNA片段，称为Southern印迹法。而后人们用类似的方法，对RNA和蛋白质进行印迹分析，对RNA的印迹分析称为No

2、rthern印迹法，对单向电泳后的蛋白质分子的印迹分析称为Western印迹法，对双向电泳后蛋白质分子的印迹分析称为Eastern印迹法。WesternBlot基本原理凝胶电泳：根据蛋白质在凝胶里的泳动速率不同，将其分离开来。转膜：用毛细管印迹法或者电泳印迹法将凝胶里的蛋白质转移到膜上，通过静电力和疏水键将蛋白质与膜表面的膜孔结合起来。封闭：用封闭液将膜表面未与蛋白质结合的孔封闭，避免在一抗与蛋白质杂交的过程中与膜孔发生非特异性结合，造成对靶蛋白的影响。一抗杂交：用与待研究的蛋白质具有特异性的抗体进行杂交，这样就可以通过

3、一抗确定待研究的蛋白质的位置。二抗杂交：用与一抗具有特异性的二抗进行杂交，标记一抗的位置。显色：二抗一般是酶蛋白，用与这种酶蛋白发生催化反应的底物与之反应，显色，标记二抗的位置，进而标记一抗、待研究蛋白质的位置。成像印迹试验中转印膜的作用：转膜电泳印迹法（湿转和半湿转）毛细管印迹法膜与蛋白质结合的原理:静电结合和疏水键结合转移膜的选择膜的抗溶剂性能：印迹试验中需要经过很多次长时间的化学试剂清洗浸泡。膜的润湿性：使用之前需要有机溶剂或缓冲溶液润湿。膜孔径的大小：决定了能够拦截的蛋白质的大小。膜与蛋白质的结合能力：单位面积与

4、蛋白质的结合量。膜的分辨率：对低浓度蛋白质的灵敏度。封闭效果：降低背景。可重复性：膜的机械强度和膜与蛋白质的结合强度。显色方式：膜的抗溶剂性以及膜本身的物化性质有关，决定了印迹试验后期对印记的检测和显色方法的选择范围。常见的印迹试验转印膜优缺点NC膜尼龙膜PVDF膜灵敏度和分辨率高高高背景低较高低材料质地干的NC膜易脆软而结实机械强度高溶剂耐受性差较差好操作方便缓冲溶液润湿，避免气泡天然亲水性100%的甲醇润湿蛋白结合能力80-110μg/cm2>400μg/cm2125-200μg/cm2检测方式常规染色，可用放射性和

5、非放射性检测不能用阴离子染料，受限制常规染色，较于NC膜可用考马斯亮蓝染色，ECL检测和快速免疫检测适用范围0.45μm一般蛋白0.2μm分子量小于20kD0.1μm分子量小于7kD低浓度小分子蛋白，主要用在核酸检测糖蛋白检测和蛋白质测序价格价格较便宜便宜较贵常见的印迹试验转印膜优缺点——尼龙膜尼龙膜机械强度高经历多次杂交、洗脱和标记后不易产生破损和变形，非常适合与核酸检测，而且超亲水性使其不需要润湿灵敏度高分辨率高：1-1000ng/lane常见的印迹试验转印膜优缺点——PVDF膜抗溶剂性好——多种显色剂蛋白结合量高P

6、VDF膜机械强度高，耐高温和各种化学试剂，能够适用各种检查和显色手段，蛋白质结合能力强，是蛋白质印迹试验的最佳选择，尤其是蛋白质测序实验中，因为PVDF的抗溶剂性使其成为转印膜的唯一选择，缺点是价格比较贵。常见的印迹试验转印膜优缺点-NC膜NC膜是蛋白质印记最广泛使用的转移介质，对蛋白有很强的的结合能力，而且适用于各种显色方法，包括同位素、化学发光、常规显色和荧光显色，背景低，信噪比高。NC膜很容易封闭，不需要特别严谨的清洗条件，而且转移到NC膜上的蛋白在合适条件下可以保存很长时间。NC机械强度较差，不适合用于需要多次重

7、复清洗的用途，而且其蛋白结合能力与纤维素纯度有关。NC膜孔径的选择：0.45μm一般蛋白，0.2μm分子量小于20kD，0.1μm分子量小于7kD。谢谢欢迎大家提出问题讨论western印迹试验中与膜有关的实验步骤有哪些？为什么要对膜进行封闭？PVDF成为蛋白质测序实验里的唯一选择是因为什么？常见的三款转印膜最主要的应用领域分别是什么尼龙膜最大的应用优势是什么？