犬腺病毒抗体ADV-Ab酶联免疫分析ELISA

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1、犬腺病毒抗体(ADV-Ab)酶联免疫分析(ELISA)试剂盒使用说明书本试剂仅供研究使用目的：本试剂盒用于测定犬血清，血浆及相关液体样本中腺病毒抗休(ADV-Ab)的含量。实验原理：本试剂盒采用双抗原夹心酶联免疫法(ELISA)测定标本中犬腺病毒抗体(ADV-Ab)。用纯化的犬腺病毒(ADV)抗原包被微孔板，制成固相抗原，可与样品中犬腺病每抗体(ADV-Ab)相结合，经洗涤除去未结合的抗体和其他成分后再与HRP标记的犬腺病毒(ADV)抗原结合，形成抗原■抗体■酶标抗原复合物，经过彻底洗涤后加底物TMB显色。TMB在HRP酶的催化

2、下转化成蓝色，并在酸的作用下转化成最终的黄色。用酚标仪在450nm波长下测定吸光度(OD值)，与CUTOFF值相比较，从而判定标本中犬腺病毒抗体(ADV-Ab)的存在与否。试剂盒组成:试剂盒组成48孔配置96孔配置保存说明书1份1份封板膜2)(48)2片(96)密封袋1个1个酶标包被板1X481X9628C保存阴性对照0.5mlX1瓶0.5mlXI瓶28C保存阳性对照0.5mlXI瓶0.5mlXI瓶28C保存酶标试剂3mlXl瓶6mix1瓶2-8°C保存样品稀释液3mix1瓶6mix1瓶28C保存显色剂A液3mlXl瓶6mix

3、1瓶2-8°C保存显色剂B液3mix1瓶6mix1瓶28C保存终止液3mlXI瓶6mlXl瓶2-8°C保存浓缩洗涤液(20mlX20倍)XI瓶(20mlX30倍)XI瓶28C保存样本处理及要求：1.血清：室温血液自然凝固10・20分钟，离心20分钟左右(2000・3000转/分)。仔细收集上清，保存过程屮如出现沉淀，应再次离心。2.血浆：应根据标本的要求选择EDTA或柠檬酸钠作为抗凝剂，混合10・20分钟后，离心20分钟左右(2000-3000转/分)。仔细收集上清，保存过程中如有沉淀形成，应该再次离心。3.尿液：用无菌管收集，

4、离心20分钟左右(2000-3000转/分)。仔细收集上清，保存过程屮如有沉淀形成，应再次离心。胸腹水、脑脊液参照实行。4.细胞培养上清：检测分泌性的成份时，用无菌管收集。离心20分钟左右(2000・3000转/分)。仔细收集上清。检测细胞内的成份时，用PBS(PH7.2-7.4)稀释细胞悬液，细胞浓度达到100万/ml左右。通过反复冻融，以使细胞破坏并放出细胞内成份。离心20分钟左右(2000-3000转/分)。仔细收集上清。保存过程中如有沉淀形成，应再次离心。1.组织标本：切割标本后，称収重量。加入一定量的PBS,PH7.4

5、。用液氮迅速冷冻保存备用。标本融化后仍然保持2・8°C的温度。加入一定量的PBS(PH7.4),用手工或匀浆器将标本匀浆充分。离心20分钟左右(2000-3000转/分)。仔细收集上清。分装后一份待检测，其余冷冻备用。2.标本采集后尽早进行提取，提取按相关文献进行，提取后应尽快进行实验。若不能马上进行试验，可将标本放于・20°C保存，但应避免反复冻融.3.不能检测含NaN3的样品，因NaN3抑制辣根过氧化物酶的(HRP)活性。操作步骤：1.编号：将样品对应微孔按序编号，每板应设阴性对照2孔、阳性对照2孔、空白对照1孑L(空白对照

6、孔不加样品及酶标试剂，其余各步操作相同)2.加样：分别在阴、阳性对照孔中加入阴性对照、阳性对照50glo然后在待测样品孔先加样品稀释液40卩1,然后再加待测样品10卩1。加样将样品加于酶标板孔底部，尽量不触及孔壁，轻轻晃动混匀，3.温育:用封板膜封板后置37°C温育30分钟。4.配液：将30(48T的20倍)倍浓缩洗涤液加蒸憎水至600ml后备用5.洗涤：小心揭掉封板膜，弃去液体，甩干，每孔加满洗涤液，静置30秒后弃去，如此重复5次，拍干。6.加酶：每孔加入酶标试剂50pl,空白孔除外。7.温育：操作同3。8.洗涤：操作同5。9

7、.显色：每孔先加入显色剂A50pl,再加入显色剂B50yl,轻轻震荡混匀，37°C避光显色15分钟10.终止：每孔加终止液50gl,终止反应(此时蓝色立转黄色)。11.测定：以空白空调零，450nm波长依序测量各孔的吸光度(OD值)。测定应在加终止液后15分钟以内进行。结果判定：试验有效性：阳性对照孔平均值＞1.00;阴性对照平均值00.10临界值(CUTOFF)计算：临界值=阴性对照孔平均值+0.15阴性判定：样品OD值v临界值(CUTOFF)者为犬腺病毒抗体(ADV-Ab)阴性阳性判定：样品OD值2临界值(CUTOFF)者为

8、犬腺病毒抗体(ADV-Ab)阳性注意事项1.操作严格按照说明书进行，本试剂不同批号组分不得混用。2.试剂盒从冷藏环境中取出应在室温平衡15・30分钟后方可使用，酶标包被板开封后如未用完，板条应装入密封袋屮保存。3.浓洗涤液对能会有结晶析岀，稀释时对在水浴中加温助