繁茂膜海绵中放线菌分离和多样性研究

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1、繁茂膜海绵中放线菌分离和多样性研究作者：张海涛指导教师：张卫研究员，靳艳副研究员（中国科学院大连化学物理研究所海洋生物产品工程组，大连，116023）摘要：海绵是迄今为止已知海洋天然产物的最大来源。由于海绵的底栖过滤性摄食和消化选择性等生理特性，其体内蕴藏了丰富的微生物种群。最近几年来，发现越来越多的海绵微生物产生很强的生物活性物质，有些并被证明是海绵天然产物的真正生产者。本文对大连海域繁茂膜海绵中的放线菌进行分离。对于得到的菌株进行16SrDNA扩增和RFLP及测序分析。研究表明海绵中蕴含着丰富的放线菌资源。其中包

2、含Streptomycetes,Nocardiopsis,Pseudonocardia,Nocardia,Micromonospora,Rhodococcus,Actinoalloteichus等属。利用HhaI进行RFLP分析能够对海绵中放线菌的16SrDNA多样性进行有效的分析，结果达到属，部分到种的级别。而从中我们也发现了一个稀有放线菌属Actinoalloteichus的新种。关键词：海绵；放线菌；RFLP；Streptomycetes；Nocardiopsis；Pseudonocardia；Nocardia

3、；Micromonospora；Rhodococcus；Actinoalloteichus1.前言海洋占地球表面积的71%，蕴藏着极为丰富的生物资源。在动物种类方面，在已知的33个动物门中，海洋中有32个，其中有15种是海洋所独有的。海绵（marinesponge）属于动物界多孔动物门（Porifera）,是一大类低等多细胞海洋动物，约占海洋物种总量的1/15，是海洋中除珊瑚外的第二大生物量，全世界约有10000~15000种。海绵虽然是一类非常简单的生物，却能产生比其它海洋生物物种更为丰富的生物活性物质，就目前所知

4、，海绵是迄今为止海洋天然产物的最大来源。天然产物研究开发的国际权威杂志“NaturalProductsReports”的每年度都进行海洋天然产物综述，从在最近三年（2002－2004）中在各类杂志上发表的海洋天然产物中看来，来源于海绵的分别占到了36.3％（316/869）、38.2％（303/793）和32.6％(247/756)1,2,4。海绵天然产物的活性主要表现为抗真菌、抗细菌、抗病毒、抗肿瘤、抗疟疾、抗污染、驱虫和酶抑制剂等活性。近些年，随着研究方法的发展和研究内容的深入，科学家从海绵中发现了越来越多的微生

5、物，并从某些微生物的代谢产物中发现了许多活性物质，而其中有些活性物质过去曾被认为是海绵本身产生的。例如Perovic从海绵Halichondriapanicea中的微生物AntarcticumVeaiculatum和Psychroserpensburtonensis中分离得到了具有神经活性的化合物6。Debitus从海绵Subereacreba中分离得到的假单胞菌能够产生的奎诺龙(Quinolone)类抗生素3。放线菌是一类具有重要工业价值的细菌，在抗生素生产和酶制剂产业中具有很重要地位7。目前大约70％的抗生素类化

6、合物都生产自放线菌。通过对分子生物学方法，对海绵中放线菌进行检测表明，海绵Rhopaloeidesodorabile中蕴含着丰富的放线菌资源8。因此对海绵中放线菌进行分离是很有价值和挑战性的工作。我们从中可以（1）分离得到具有重要价值的放线菌资源，发现更多的放线菌，并进行其分离方法学的研究以获得新的微生物；（2）探索海绵天然产物的真正来源。我们已经在对海绵研究中发现很多具有新活性和新结构的化合物。如果确定其真正来源是其中的放线菌，就可以改变培养方法，通过对放线菌的培养，大规模的获得这些有价值的化合物；（3）海绵同其中

7、的微生物的共生关系也是非常引人关注的研究热点。有些化合物是只有海绵和其微生物共同作用才能生产的。在此期间，海绵中的微生物可以提供海绵天然产物合成的前体化合物、营养物质（如碳源等）、信号分子等等。因此随着对海绵微生物尤其是放线菌研究的深入，对于我们从更广角度了解海绵天然产物，并依靠这些信息指导海绵细胞培养和代谢调控都有很重要的参考价值。海绵中微生物由于其生长条件特殊，通常难以培养，形态多变，不易进行鉴定。随着分子生物学技术的发展，16SrDNA已经成为微生物鉴定的一个重要指标。能够为菌株的种群归属提供精确的信息。而对于

8、16SrDNA的限制性长度多态分析（RFLP）也是对细菌种属鉴定的一个重要方法。它利用限制性内切酶对于序列的特定位点进行识别，从而特异性的对DNA进行酶切。不同的序列在同种内切酶的作用下，会得到长度不同的片断。从而达到对不同菌株的区分。潮间带的繁茂膜海绵在大连海域分布比较广泛。在我们的研究中发现很多具有新活性和新结构的化合物9。因此我们的工作集