实时荧光定量PCR操作步骤.pdf

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1、CodeNo.RR820A研究用®SYBRPremixExTaq™II(TliRNaseHPlus)说明书v201412Da目录内容页码●制品说明1●试剂盒原理1●制品内容2●试剂盒外必备主要试剂和仪器2●保存2●使用注意3●操作方法3●实验条件的选择8●附录9●质量标准11●关联产品11●制品说明®*本制品是采用SYBRGreenI嵌合荧光法进行RealTimePCR的专用试剂。制品中含有RealTimePCR®反应的最适浓度SYBRGreenI，是一种2×浓度的PremixType试剂，进行实验时，PCR反应液的配制十分方便简单。本制

2、品中还添加了TliRNaseH(耐热性RNaseH)，以cDNA作为模板进行PCR反应时，可以最大限度抑制由于cDNA中残存mRNA对PCR反应造成的阻害作用。®本制品Buffer经过改良，使反应特异性比SYBRPremixExTaq(TliRNaseHPlus)（CodeNo.RR420A）更高。能抑制非特异性反应，可以在宽广的范围内进行更加准确的定量。本Buffer和HotStart法用DNA聚合酶TaKaRaExTaqHS组合使用，可以进行重复性好、可信度高的RealTimePCR解析。特长：1.适用于RealTimePCR反应，可

3、以快速、准确地对目的基因进行检测、定量。®2.在2×浓度的Premix中，预先混有SYBRGreenI，PCR反应液配制时，只需加入模板、引物、灭菌蒸馏水便可进行RealTimePCR反应，操作简单方便。3.DNA聚合酶使用了TaKaRaExTaqHS，可以进行HotStart法PCR反应，再与TakaraBio公司独自开发的Buffer系统相结合，具有高扩增效率，高扩增灵敏度之特点。4.在2×浓度的Premix中，预先添加了耐热性RNaseH(TliRNaseH)，可以最大限度抑制以cDNA作为模板进行PCR反应时，由于cDNA中残存m

4、RNA对PCR反应造成的阻害作用。®®*：TakaraBio使用SYBRGreenI作为研究试剂已得到MolecularProbesInc.的许可。SYBR为MolecularProbesInc.的注册商标。●试剂盒原理本制品使用了改良后的TaKaRaExTaqHS进行PCR扩增，通过检测反应液中SYBRGreenI的荧光强度，达到监控PCR产物扩增量的目的。1．PCRPCR法是以微量DNA进行目的片段扩增的方法。通过DNA链的热变性、引物退火、DNA聚合酶作用下引物的延伸三个步骤循环往复，可在短时间内扩增DNA达100万倍以上。本制品中

5、的DNA聚合酶由于使用了TaKaRaExTaqHS，从而抑制在调制反应液等低温条件下由引物产生的非特异性退火或引物二聚体引起的非特异性扩增，大大提高PCR扩增灵敏度。2．嵌合荧光检测法®®SYBRGreenI与双链DNA结合后发出荧光，所以可以通过检测反应体系中的SYBRGreenI荧光强度，达到检测PCR产物扩增量的目的。®具体原理见下图。通过PCR反应生成双链DNA，SYBRGreenI与双链DNA结合发出荧光，通过检测PCR反应液中的荧光信号强度，可以对目的基因进行准确定量，同时还可以测定扩增的目的DNA片段的融解温度。Primer

6、荧光物质1．热变性Polymerase2．引物退火3．延伸反应-1-●制品内容（50μl反应×200次）®*1SYBRPremixExTaqII（TliRNaseHPlus）（2×Conc.）1.0ml×5支*2ROXReferenceDye（50×Conc.）200μl×1支*2ROXReferenceDyeII（50×Conc.）200μl×1支2+®*1内含TaKaRaExTaqHS，dNTPMixture，Mg，TliRNaseH，SYBRGreenI等。*2ROXReferenceDye是用以校正孔与孔之间产生的荧光信号误差。例

7、如使用LifeTechnologies公司的RealTimePCR扩增仪进行实验就需要校正。◆需要使用ROXReferenceDye校正的仪器AppliedBiosystems7300Real-TimePCRSystemAppliedBiosystemsStepOnePlusReal-TimePCRSystem(LifeTechnologies)◆需要使用ROXReferenceDyeII校正的仪器AppliedBiosystems7500和7500FastReal-TimePCRSystem(LifeTechnologies)◆不需要校

8、正的仪器ThermalCyclerDice™RealTimeSystemSingle(CodeNo.TP850/TP870)LightCycler/LightCycler480System(R