外源基因在原核细胞中的表达.ppt

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1、基因工程原理纲要第一讲基因工程概论属实第二讲基因工程的主要技术第三讲基因工程的酶学基础第四讲基因克隆的载体与受体第五讲目的基因的克隆与分离第六讲克隆基因的检测与鉴定第七讲克隆基因的表达与产物纯化第八讲基因表达的调控第七讲基因的表达、调节与产物纯化第一节外源基因在原核细胞中的表达一、原核生物基因表达的特点1.只有一种RNA多聚酶识别原核细胞的启动子，催化所有的RNA合成。2.以操纵子为单位数个相关的结构基因与其调控区结合形成一个表达的协同单位。3.转录和翻译偶联、连续进行。4.不含内含子，缺乏转录后的加工系统。5.调控主要在转录水平上。

2、6.mRNA的核糖体结合位点。Shine-Dalgarno（SD）sequence:含有一个启始密码子和一段同核糖体16SRNA3’末端碱基互补的序列，叫Shine-Dalgarno（SD）序列。二、原核表达系统的注意事项1.外源基因不能带有内含子。2.必须用cDNA3.不能直接用真核基因组DNA。4.必须利用原核细胞的调控原件（启动子等）5.防止外源基因产物对宿主细胞的毒害。三、原核生物基因表达的调控1.启动子是DNA上的能与RNA聚合酶结合并能起始mRNA合成的序列。（1）启动子序列大肠杆菌的所有启动子中都有两段一致顺序（cons

3、ensussequence）。-35Box和-10Box①-35boxRNA聚合酶δ亚基的识别位点。5’–TTGACA-3’②-10box（PribnowBox）5’–TATAAT-3’5’TTGACATATAAT转录起始位点17bp核糖体结合位点（2）翻译的起始位点①核糖体结合位点（RBS）ribosomebindingsite1）Shine-Dalgarno（SD）sequence：2）起始密码：位于SD序列下游。AUG(91%)GUG(8%)UUG(1%)2.RNA多聚酶大肠杆菌只有一种类型的RNA多聚酶转录tRNA，rRNA和

4、mRNA。结构全酶是一个5聚体，含有两个α小亚基，和2两个大亚基（β和β′），一个σ亚基。3.转录终止子在表达载体克隆位点的下游一般设计一段转录终止子。启动子操纵子S-D序列目的基因终止子内终止子intrinsicterminator：E.coli中促使转录终止的DNA位置有一段反向回文顺序，其后紧接一串A，称为内终止子，形成终止信号。原因：①茎环结构②多聚A/U反向回文顺序被转录后，立即形成一个茎环结构，使转录物与模板之间配对的碱基数降低，整个减弱了RNA与DNA的互作。由于茎环3’段紧接一串A/U的配对，稳定性比较差，有利于转录物

5、脱落而不利于转录延续。4.翻译终止密码5.翻译增强子大肠杆菌偏爱UAAU。一般安置上全部的三个终止密码防止核糖体跳跃（skipping）。Translationenhancer能够显著增强外源基因在大肠杆菌细胞中的表达效率的特殊序列。T7噬菌体基因10前导序列（简称g10-L序列）;大肠杆菌atpE基因mRNA5’-UTR中富含U的区段。6.基因工程常用的原核启动子（1）最佳启动子必须具备的条件①必须是一种强启动子能使外源基因的蛋白产量达到细胞总蛋白的10%-30%以上。②应呈现低水平的基础转录③应是可诱导型的便于表达毒性蛋白等。用温

6、度或化学试剂诱导。（2）乳糖启动子lac来自大肠杆菌的乳糖操纵子。用乳糖或其类似物IPTG充当诱导物，与阻遏蛋白结合，解除抑制。PlacO目的基因调控区CAP结合位点启动序列操纵序列结构基因Z：β-半乳糖苷酶Y：透酶A：乙酰基转移酶ZYAOPDNAmRNA阻遏蛋白IDNAZYAOPpol没有乳糖存在时阻遏基因mRNA阻遏蛋白有乳糖存在时IDNAZYAOPpol启动转录mRNA乳糖半乳糖β-半乳糖苷酶①乳糖操纵子控制区的结构“可移动的lac启动子小片断”组成：阻遏物作用区CAP作用区RNA聚合酶作用区长度：203bp的HaeIII片断（

7、包括β-半乳糖苷酶的前8个密码）。大肠杆菌乳糖操纵子控制区的结构（3）色氨酸启动子trp来自大肠杆菌的色氨酸操纵子。（4）PL和PR启动子四、外源蛋白在大肠杆菌中的表达部位1.细胞质中表达包涵体（inclusionbody）是存在于细胞质中的一种不溶性蛋白质聚集折叠而成的晶体结构物。形成原理未知。①优点②缺点使重组蛋白易于分离、免受蛋白酶降解、不损害寄主细胞回收的蛋白生物活性差。例：在大肠杆菌细胞内表达人生长激素（humangrowthhormone,hGH）。2.周质中表达（1）周质（periplasm）格兰氏阴性大肠杆菌位于内膜和

8、外膜之间的细胞结构部分。蛋白质从细胞质转运到周质的复杂机理目前不完全清楚优点：容易被浓缩和纯化、有利于正确折叠、被降解的少。①常用的原核信号肽（2）信号肽（signalpeptide）能带领蛋白穿过膜到达周质。但以后需要