db13t1080-2009乳及乳制品中β-内酰胺酶的测定.pdf

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1、ICS67.100X16DB13河北省地方标准DB13/T1080-2009乳及乳制品中p一内酞胺酶的测定Detectionof(3-lactamasesinmilkandmilkproducts2009-05-27发布2009-06-11实施河AL省质RIP技术11/I--督局发布DB13/T1080-2009.舀L.J.目月U青本标准的附录A和附录C为规范性附录，附录B为资料性附录。本标准由河北省质量技术监督局提出并归口。本标准第一法由河北省食品质量监督检验研究院起草。本标准第二法由河北省食品质量监督检验研究院起草。本标准第三法由河北省科学院生物所起草。本标准第一法主要起

2、草人:周正、周巍、李丛芬、穆燕魁、张岩。本标准第二法主要起草人:李挥、张敬轩、庞坤、范斌、张岩。本标准第三法主要起草人:闰静辉、陈英珠、昊萌、程华、李春生、张小兵、董超、李亚璞。DB13/T1080-2009乳及乳制品中p一内酞胺酶的测定第一法杯碟法1范围本标准规定了乳及乳制品中R一内酞胺酶的检验方法一杯碟法。本标准适用于生鲜乳、巴氏杀菌乳及灭菌乳中具有活性且对舒巴坦敏感的卜内酞胺酶的检验。木方法的检出限为4U/:nLo2原理该方法采用对青霉素类药物绝对敏感的标准菌株，利用舒巴坦特异性抑制p一内酞胺酶的活性，并以青霉素作为指示物，通过比对加人R一内酞胺酶抑制剂与未加人抑制剂的

3、样品所产生的抑菌圈的大小来间接测定样品中的R一内酞胺酶。3设备和材料3.1抑菌圈测量仪或测量尺。3.2恒温培养箱:36℃土19Co3.3高压灭菌器。3.4无菌培养皿:内径90mm，具陶瓦盖。3.5无菌牛津杯:外径(8.0土0.1)mm，内径(6.0土0.1)mm，高度(10.010.1)mm,3.6麦氏比浊仪或标准比浊管。3.7无菌吸管:1mL(0.01mL刻度值)，10mL(0.1mL刻度值)。3.8加样器:55L^205L,205L-2005L及配套吸头。4培养基和试剂除另有规定外，所用试剂均为分析纯，水为GB/T6682中规定的三级水。4.1试验菌种:藤黄微球菌(Mic

4、rococcusluteus,CMCC(B)28001)，使用菌株代数3-14代。4.2磷酸盐缓冲溶液:按附录A中A.1规定。4.3生理盐水(8.5g/L):按附录A中A.2规定。4.4青霉素标准溶液:按附录A中A.3规定。4.5(3一内酞胺酶标准溶液:按附录A中A.4规定。4.6舒巴坦标准溶液按附录A中A.5规定。4.7营养琼脂培养基:按附录A中A.6规定。4.8抗生素检测用培养基I:按附录A中A.7规定。4.9空白牛奶:按附录A中A.8规定5操作步骤5.1菌悬液的制备将藤黄微球菌接种于营养琼脂斜面上，经3611℃培养18h^-22h，用无菌生理盐水洗下菌苔即为DB13/T

5、1080-2009菌悬液，测定菌悬液浓度，终浓度应大于1X1010CFU/mL,4℃保存，贮存期限2周。5.2样品的制备将待检样品充分混匀，取1mL待检样品于1.5mL离心管中共4管，分别标为:A,B,C,D，每个样品做三个平行。5.3对照的制备5.3.1阴性对照，每次检验应取空白牛奶1mL加人到1.5mL离心管中共四管，分别标为:A,B,C,D，每次实验均做三个平行作为对照。5.3.2阳性对照，取空白牛奶1mL加入到1.5mL离心管中，加人p一内酚胺酶标准溶液255L，共做四管，分别标为A,B,C,D，每次实验均做三个平行作为对照。5.4检验用平板的制备取90mm灭菌培养皿

6、，底层加10mL灭菌的抗生素检测用培养基丑，凝固后上层加入5mL含有浓度为1X108CFU/mL藤黄微球菌的抗生素检测用培养基I，每个检验用平板上均匀放置4个无菌牛津杯。5.5样品的测定按照下列顺序分别将青霉素标准溶液、p一内酞胺酶标准溶液、舒巴坦标准溶液加人到5.2各离心管中:A青霉素55LoB舒巴坦255L、青霉素5pLocp一内酞胺酶25pL(终浓度4U/mL)、青霉素55LoDR一内酞胺酶255L(终浓度4U/mL)、舒巴坦255L、青霉素5pLo将上述A-D试样混匀后各取200林L加人放置于检验用平板上的4个无菌牛津杯中，36土1℃培养18-22h,测量抑菌圈直径。

7、取三组平行试验平均值。6结果观察各平行试验结果差异应小于2.0mm;阴性对照与阳性对照结果应符合表1实验现象，则可进行结果报告。表1实验现象对应表阴性对照阳性对照A抑菌圈直径应在20土2.0mm范围内B、D均产生抑菌圈B.D均产生抑菌圈C抑菌圈与D抑菌圈差异大于等于3.0mmC抑菌圈与D抑菌圈差异大于等于3.0mmA抑菌圈与B抑菌圈差异小于3.0mmA抑菌圈与B抑菌圈差异大于等于3.0mm7结果报告7.1样品结果同阳性对照结果实验现象一致可判定检验结果阳性。7.2如样品结果同阴性对照结果现象一致可判定检