蛋白质印迹法westernblot应用介绍.ppt

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1、威斯腾生物技术中心2014.9.1蛋白质印迹法（westernblot技术）WesternBlot介绍WesternBlot一般流程WesternBlot常见问题分析WesternBlot介绍蛋白质印迹的发明者一般认为是美国斯坦福大学的乔治·斯塔克（GeorgeStark）。在尼尔·伯奈特（NealBurnette）于1981年所著的《分析生物化学》（AnalyticalBiochemistry）中首次被称为WesternBlot。蛋白免疫印迹(WesternBlot)是将电泳分离后的细胞或组织总蛋白质从凝胶转移到固相支持物NC膜或PVDF膜上，然后用特异性抗体检测

2、某特定抗原的一种蛋白质检测技术，现己广泛应用于基因在蛋白水平的表达研究、抗体活性检测和疾病早期诊断等多个方面。WesternBlot流程（1）贴壁细胞蛋白样品收集A收集培养瓶或六孔板中的培养液转移至离心管中。B加入PBS冲洗2-3遍，再将PBS转移至离心管中，离心收集细胞。C将细胞培养瓶或六孔板置于冰上，然后将离心好的离心管中的液体小心倾尽并放置于冰中，加入含PMSF的RIPA裂解液200μl于离心管中并移至对应的培养瓶中，摇晃培养瓶使裂解液与贴壁的细胞充分接触，冰上裂解30min。D裂解结束后用细胞刮将贴壁的细胞刮下并转移至1.5mlEP管中，再用超声破碎仪破碎细

3、胞后，4℃下12000rpm离心15min，吸取上层液体于新的离心管中，弃掉沉淀。收集蛋白样品(Proteinsamplepreparation)分多次将细胞收至一个管中（2）．蛋白含量测定（福林-酚法）目前常用比色法测定样品蛋白的含量：Bradford法（考马斯亮蓝法）、Lowry法（福林-酚试剂法）、BCA法等。1、配制BSA标准溶液：0、25、50、100、150、200、300μg/mL（用PBS配制）。样品液：取原液2μL至200μL（用PBS配制）。2、操作：先取一块新的96孔板，于630nm下测光密度值，取溶液/样品40μL和E液40μL，每个浓度点均

4、作三复孔，振荡混匀。37°C反应10min后，加入福林酚试剂（1:15稀释）160μL，振荡混匀，37°C反应30min。630nm下测光密度值。以标准蛋白浓度对光密度值作出标准曲线，计算待测样品蛋白浓度。SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳分离胶浓度与蛋白分离范围凝胶浓度（％）最佳分离范围（KD)650-150830-901020-801212-601510-401、配制下层胶（分离胶）静置1h后制上层胶（浓缩胶）2、配制上层胶（浓缩胶）加完后插上梳子，静置1h(1)SDS-PAGE凝胶配制制胶操作时要使两玻璃对齐，以免漏胶。加完分离胶后胶，加水液封时要很慢，否则胶会被冲变型

5、。灌胶时开始可快一些，胶面快到所需高度时要放慢速度。操作时胶一定要沿玻璃板流下，这样胶中才不会有气泡。分离胶充分凝固就倒去胶上层水并用吸水纸将水吸干。插梳子时要使梳子保持水平。制胶过程注意事项：(2)上样与电泳将制备好的样品溶解后，把蛋白样品直接上样到SDS-PAGE胶加样孔内即可。跑上层胶，70V35Ma/块45min；跑下层胶，100V35Ma/块胶1h左右。转膜(Transfer)半干转移法将凝胶和固相基质象三明治一样夹在用缓冲液湿润滤纸间。－

6、纸

7、胶

8、膜

9、纸

10、＋槽式湿转法将凝胶和固相基质夹在滤纸中间，浸泡在转移装置的缓冲液中。－

11、海绵

12、纸

13、胶

14、膜

15、纸

16、海绵

17、

18、＋转膜注意事项滤纸、胶、膜之间不能有气泡。滤纸、胶、膜的大小和摆放顺序。胶和膜上要做好标记，识别正反面和上下。PVDF膜需要100%甲醇预处理，后续操作中膜必须保持湿润。转膜条件：推荐：100V，1—2小时；根据蛋白大小以及胶厚度的不同而不同。转膜后检测（此步可以省略）丽春红染色蛋白带出现后，于室温用去离子水漂洗硝酸纤维素滤膜，换水几次。印度墨汁染色只用于放射性标记抗体或放射性标记A蛋白探针的Western印迹过程。封闭(Blocking)将转印膜浸泡到封闭液中，将膜上没有结合蛋白质的区域结合上蛋白质，目的是使抗体与特异的蛋白质结合。封闭液5%TBST脱脂奶粉溶液（

19、30ml）牛血清白蛋白溶液(BSA)摇床上缓慢摇动封闭，室温2h或4℃过夜。Tween-20的作用：减少非特异性吸附，不影响抗体与抗原的结合。一抗孵育(Primaryantibodyincubation)把NC膜放在密闭塑料袋或者培养皿中，加入稀释好的一抗，室温或4℃在侧摆摇床上缓慢摇动孵育一小时。如果一抗孵育一小时效果不佳，可以4℃缓慢摇动孵育过夜。或更据抗体的说明选择适当的孵育温度和时间。回收一抗。加入TBST液，在侧摆摇床上缓慢摇动洗涤5-10分钟。吸尽洗涤液后，再加入洗涤液洗涤5-10分钟。共洗涤3次。如果结果背景较高可以适当延长洗涤时间并增加洗涤次数。