植物组织培养.ppt

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1、第九章植物细胞、组织及器官的超低温保存植物种质资源是植物育种的基础，种质资源的保存方式有原生境保存和非原生境保存，非原生境保存包括移地保存（种质圃或植物园保存）、种质（种子）库保存、离体保存等。其中种质资源的离体自20世纪60年代逐渐得到广泛应用。种质资源的离体保存是对离体培养的小植株、器官、组织、细胞或原生质体等材料，采用限制生长、延缓或停止其生长的处理使之保存，在需要时可以重新恢复其生长，并再生植株的方法。离体保存又分为限制生长保存和超低温保存。限制生长保存是利用限制离体培养物的生长速度来保存种质的方法，是离体保存的常用方法。限制离体培养物生长速度的方法主要有：（1

2、）低温保存法（2）高渗透压保存法（3）生长抑制剂保存法（4）降低氧分压保存法（5）干燥保存法而超低温保存是将要保存的材料经过适当处理后，保存在液氮中（-196℃），植物细胞生长停止，但细胞活力和形态发生潜能得到了保存。1949年Polge发现甘油具有保存特性，标志着低温生物学的形成；1980年开始进行玻璃化保存，开展超低温保存研究。动物细胞、组织、胚胎---植物细胞、组织、器官一、超低温种质保存的发展历史：保持细胞培养物的遗传稳定性；2.长期保存植物的种质资源;长期保存农作物的优良品种及其育种亲本材料的种质；建立长期保存的茎尖分生组织种质库及无病毒的原种；5.保存实验材

3、料，防止再培养中遗传变异。二、超低温保存的作用及意义在低于-700C的超低温条件下，有机体细胞内部的生化反应极其缓慢，甚至终止。因此采取适当的方法将生物材料降至超低温，即可使生命活动固定在某一阶段而不衰老死亡。当以适当的方法将冻存的生物材料恢复至常温时，其内部的生化反应可恢复正常。三、超低温保存的原理及理论依据所谓冷冻保存，就是将体外培养物或生物活性材料悬浮在加有或不加冷冻保护剂的溶液中，以一定的冷冻速率降至零下某一温度（一般是低于-700C的超低温条件），并在此温度下对其长期保存的过程。而复苏就是以一定的复温速率将冻存的体外培养物或生物活性材料恢复到常温的过程。不论是

4、微生物、动物细胞、植物细胞还是体外培养的器官都可以进行冻存，并在适当条件下复苏。水在低于零度的条件下会结冰。如果将细胞悬浮在纯水中，随着温度的降低，细胞内外的水分都会结冰，所形成的冰晶会造成细胞膜和细胞器的破坏而引起细胞死亡。这种因细胞内部结冰而导致的细胞损伤称为细胞内冰晶损伤。如果将细胞悬浮在溶液中，随着温度的降低，细胞外部的水分会首先结冰，从而使得未结冰的溶液中电解质浓度升高。如果将细胞暴露在这样高溶质的溶液中且时间过长，细胞膜上脂质分子会受到损坏，细胞便发生渗漏，在复温时，大量水分会因此进入细胞内，造成细胞死亡。这种因保存溶液中溶质浓度升高而导致的细胞损伤称为溶质

5、损伤或称溶液损伤。当温度进一步下降，细胞内外都结冰，产生冰晶损伤。但是如果在溶液中加入冷冻保护剂，则可保护细胞免受溶质损伤和冰晶损伤。因为冷冻保护剂容易同溶液中的水分子结合，从而降低冰点，减少冰晶的形成，并且通过其摩尔浓度降低未结冰溶液中电解质的浓度，使细胞免受溶质损伤，细胞得以在超低温条件下保存。在复苏时，一般以很快的速度升温，1-2分钟内即恢复到常温，细胞内外不会重新形成较大的冰晶，也不会暴露在高浓度的电解质溶液中过长的时间，从而无冰晶损伤和溶质损伤产生，冻存的细胞经复苏后仍保持其正常的结构和功能。冷冻保护剂对细胞的冷冻保护效果还与冷冻速率、冷冻温度和复温速率有关。

6、而且不同的冷冻保护剂其冷冻保护效果也不一样。1.主要仪器设备(1)用于组织和细胞培养的全套设备；(2)普通电冰箱；(3)-70℃--80℃的低温冰箱；(4)程序降温器；四、超低温保存的基本设备和程序(5)玻璃或塑料试管（5ml或10m1），封盖严密，不进液氮；(6)液氮;(7)光学显微镜和紫外荧光显微镜；(8)分光光度计。2.基本程序(1)材料的准备与选择。(2)预处理。(3)将材料装入试管，并随即插入冰浴中。(4)加入0℃预冷的冰保护剂，在0℃(冰浴中)放置30一45分钟。(5)降温冰冻。(6)保存后的化冻：一般在37—40℃温水浴中快速化冻。(7)活力测定,通常采用

7、TTC法(氯化三苯四氮唑还原法)。如果是单细胞或原生质体，可采用活性荧光素染色法，显示活细胞，统计存活率。(8)再培养，观察组织细胞恢复生长的速度、存活率、植株的再生能力。(9)遗传性状的分析：如植株的形态特征、生长发育状况、染色体、同工酶及抗逆性等。1．材料的特性；基因型、抗冻性、器官组织和细胞年龄、生理状态。2．预处理目的：A.增加细胞分裂和同步化；B.减少细胞内自由水的含量；C.增强细胞的抗寒性。五、影响超低温保存效果的主要因素预处理方法：(1)细胞、组织继代培养中．细胞分裂分化同步化的调控，增加指数生长期细胞。(2)预培养，增加培