质粒不稳定性.ppt

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1、质粒载体的不稳定性分析质粒载体不稳定的现象克隆有外源基因的质粒载体转移到大肠杆菌受体细胞之后，会产生一系列的生理效应，影响到自身的稳定性、可能引起形态学上的变化：丝状现象和脆性增加。产生无质粒的突变体或拷贝数低的突变体。结构重排导致无法正常表达的突变体。质粒载体不稳定性的类型分离不稳定性指在细胞分裂的过程中，有一个子细胞没有获得质粒DNA拷贝，并最终增殖为无质粒的优势群体机构不稳定性由转位作用和重组作用所引起的质粒DNA的重排和丢失。结构不稳定性原因：DNA的丢失，插入和重排。人工构建的多个串联启动子的质粒载体容易发生丢失作用。寄主染色

2、体及质粒载体的IS因子或转位因子，同样也会引起结构的不稳定性。共同特征：同向重复序列之间的同源重组（shortdirectrepeat).例如：用含有酪氨酸操纵子的多拷贝质粒载体转换大肠杆菌tryR菌株时，由于IS1因子的插入效应，结果产生出具有插入或者缺失的修饰型的质粒载体。分离的不稳定性原因：细胞分裂过程中的质粒的不平均分配。由于缺陷性分配（defectivepartitioning）所造成的质粒的丢失现象叫做质粒分离的不稳定性。质粒稳定遗传的两个必要条件：一、平均每个时代每个质粒至少发生一次复制；二、细胞分裂时，复制产生的质粒拷贝

3、必须分配到两个子细胞中去。质粒拷贝分配到子细胞的途径可分为主动分配和随机分配两种不同的方式。主动分配的方式有两种:平均分配--每个子细胞刚好获得一半数目的质粒拷贝配对位点分配—只有一对质粒呈主动分配，其他的随机分配。由于主动分配存在着有效的质粒拷贝数控制系统，从而保证了质粒的高度稳定。随机分配在细胞分裂过程中质粒拷贝数在两个子细胞中随机分配。影响质粒载体稳定性的主要因素新陈代谢符合对质粒载体稳定性的效应拷贝数差异对质粒载体稳定性的影响寄主重组体系对质粒载体稳定性的效应新陈代谢符合对质粒载体稳定性的效应质粒载体增加给宿主细胞DNA复制效应

4、曲线。即宿主细胞生长速片度与质粒载体的分子量的大小成正比，克隆的外源DNA段越大，寄主细胞生长缓慢的时间就越长。拷贝数差异对质粒载体稳定性的影响差异：同样的大肠杆菌培养物中，每个细胞所拥有的质粒载体拷贝数是不尽相同的，这种不同的细胞个体之间的质粒载体拷贝数差异程度，简称差度。无质粒载体细胞的速度是由分裂细胞中的质粒载体拷贝平均值数决定的。（实际质粒载体拷贝数是实验测定大量细胞的）差度是影响质粒载体丢失的速率，也是造成质粒载体不稳定的原因之一。具低差度分布特性的质粒载体相当的稳定，具有高差度分布特性的质粒载体稳定性较差。位于后者的这种分布

5、的低拷贝数的一段产生无质粒载体细胞的频率相当高。寄主重组体系对质粒载体稳定性的效应质粒寡聚体同样是造成质粒不稳定性的重要原因之一。寡聚化作用普遍存在于含有大分子量插入片段的克隆载体。实验证明，pBR322派生载体中，寡聚化程度与插入片段大小存在相关性。决定大肠杆菌培养物中含质粒寡聚体细胞的比例有两种主要的因素：一、质粒DNA分子间的重组频率；二、含质粒寡聚体细胞生长速率。影响质粒重组的突变同样也会影响质粒的稳定性。实验观察表明，在重组缺陷(rec-)的大肠杆菌寄主细胞中，基因工程常用载体pBR322和pUC当以单体形式存在时最稳定。随着

6、质粒寡聚体比例的逐渐上升，其稳定性就相应的下降。一般情况下,质粒的结构不稳定性可以通过宿主菌株的谨慎和恰当的选用来消除。因此在质粒不稳定性的研究过程中,人们关注最多的,通常是质粒的分离不稳定性。产腈水合酶重组大肠杆菌的质粒稳定性研究本文对成功构建的腈水合酶(nitrilehydratase,NHase)高表达的重组大肠杆菌E.coliBL21(DE3)/pETNHM(Kanr)的重组质粒pETNHM在重组菌株中的质粒稳定性进行了研究。质粒pETNHM的结构稳定性质粒pETNHM是将α亚基起始密码子突变的诺卡氏菌腈水合酶基因插入商品化的p

7、ET28a(+)(Novagen公司)质粒载体而得到的,插入位点为NcoI和BamHI在LB培养基中对重组E.coliBL21(DE3)/pETNHM每隔6h进行反复的传代培养,约60代后收获细胞提取质粒,并对初始构建的质粒和传代培养后的质粒分别以EcoT22I单酶切及NcoI和BamHI双酶切，然后琼脂糖凝胶电泳。由图可见,连续传代60代后收获的质粒样品采用EcoT22I单酶切及NcoI和BamHI双酶切后,分别获得了与初始质粒完全相同的预期长度基因片段(EcoT22I单酶切:4.1kb、2.2kb和0.3kb,其中0.3kb的片断因

8、为太小而在琼脂糖凝胶电泳中检测不到;NcoI和BamHI双酶切:5.3kb和1.3kb)。进一步将连续复制60代后的质粒转入宿主E.coliBL21(DE3),并对重组菌进行腈水合酶的诱导表达,结果表明腈水