高效液相色谱知识.ppt

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1、第二十章高效液相色谱法highperformanceliquidchromatography；HPLC分析化学教研室　李发美教授1经典液相色谱法为基础，引入气相色谱法的理论和实验技术，高压输送流动相，高效固定相及高灵敏度检测器，现代液相色谱分析方法。2与经典液相色谱法相比颗粒极细（一般为10m以下）、规则均匀的固定相，(键合相)传质阻抗小，柱效高，分离效率高；高压输液泵输送流动相，流速快，分析速度快；高灵敏度检测器，灵敏度大大提高。紫外检测器最小检测限可达109g，而荧光检测器最小检测限可达10

2、12g。3与气相色谱法相比不受试样的挥发性和热稳定性的限制，应用范围广；可选用各种溶剂作为流动相，对分离的选择性有很大作用，选择性高；一般在室温条件下进行分离，不需要高柱温。4第一节高效液相色谱法的主要类型和原理一、主要类型四类基本类型色谱法分配色谱法（partitionchromatography）吸附色谱法（adsorptionchromatography）离子交换色谱法（IEC）空间排阻色谱法（SEC）5第一节高效液相色谱法的主要类型和原理一、主要类型四类基本类型色谱法分配色谱法（parti

3、tionchromatography）吸附色谱法（adsorptionchromatography）离子交换色谱法（IEC）空间排阻色谱法（SEC）化学键合相色谱法6其他色谱类型亲合色谱法（affinitychromatography；AC）手性色谱法（chiralchromatography；CC）胶束色谱法（micellarchromatography；MC）电色谱法（electrochromatography；EC）7二、化学键合相色谱法以化学键合相为固定相的色谱法，简称键合相色谱法(bond

4、edphasechromatography；BPC)化学键合相：采用化学反应的方法将官能团键合在载体表面所形成的固定相8优点：固定相的均一性和稳定性好，在使用过程中不易流失，使用周期长；柱效高；重现性好；能使用的流动相和键合相的种类多，分离的选择性高正相（normalphase，NP）和反相（reversedphase，RP）键合相色谱法：根据化学键合相与流动相极性的相对强弱9（一）正相键合相色谱法固定相：极性键合相如氰基（－CN）、氨基（－NH2）或二羟基键合硅胶。（经典：水饱和的硅胶）流动相：非

5、极性或弱极性溶剂加极性调整剂如烷烃加醇类。（与水不混溶的溶剂）适用范围：溶于有机溶剂的极性至中等极性的分子型化合物如一些在硅胶柱上分离的物质10正相键合相色谱法分离机制？分配：把有机键合层作为一个液膜看待，溶质在两相的溶解吸附：溶质与键合极性基团间的诱导、氢键和定向作用分离选择性：极性强的组分k大，后洗脱出柱。流动相的极性增强，洗脱能力增加，使组分k减小，tR减小。11（二）反相键合相色谱法固定相：非极性键合相如十八烷基硅烷（C18，ODS）、辛烷基（C8）键合硅胶流动相：水为基础溶剂，加入一定量与

6、水混溶的极性调整剂常用甲醇－水、乙腈－水等应用：最广。非极性至中等极性的组分，（还有有机酸、碱及盐等）12保留机制疏溶剂理论（solvophobictheory）溶质的保留主要是溶质分子与极性溶剂分子间的排斥力，促使溶质分子与键合相的烃基发生疏水缔合。不是溶质分子与键合相间的色散力，13反相键合相色谱法保留行为的主要影响因素1、溶质的分子结构（极性）极性越弱，疏水性越强，k越大，tR也越大。同系物碳数越多，极性越弱，k越大；引入极性取代基，降低疏水性，k值变小。2、固定相键合烷基的疏水性随碳链的延长

7、而增加，溶质的k也增大。硅胶表面键合烷基的浓度越大，则溶质的k越大。14反相键合相色谱法保留行为的主要影响因素3、流动相极性越强，洗脱能力越弱，使溶质的k越大溶剂种类：水为弱溶剂，醇为强溶剂溶剂比例：水的比例增加，使k增大中性盐的加入：使中性溶质的k增大pH：影响弱酸、弱减的离解流动相的pH降低，弱酸k增大，tR增大；弱碱k变小。15离子抑制色谱法（ionsuppressionchromatography；ISC）用少量弱酸、弱碱或缓冲溶液，调节流动相的pH，抑制有机弱酸、弱碱的离解，增加疏水缔合作

8、用，使k变大。适用于3≤pKa≤7的弱酸、7≤pKa≤8的弱碱反相键合相色谱法16把离子对试剂加入到含水流动相中，组分离子在流动相中与离子对试剂的反离子（counterion）生成中性离子对，增加溶质与非极性固定相的作用，使k增加，改善分离效果。（三）反相离子对色谱法pairedionchromatography；PICionpairchromatography；IPC17反相离子对色谱法离子对模型33++()+3s3(+固定相+()+B)+B+H+BHRSONaR