基因重组及遗传分析.ppt

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1、第五章细菌基因重组及遗传分析基因重组（generecombination）是指不同来源的遗传物质通过转移和交换而重新组合的过程。高等动植物和许多产生有性孢子的真核微的基因重组都是通过有性世代来完成。在细菌中，提供部分遗传物质或少数基因的一方称为供体（donor），而获得基因的另一方称为受体（recipient）。第一节转化（Transformation）转化：是指某一基因型的细胞从周围介质中吸收来自另一基因型细胞的DNA而使受体的基因型和表型发生相应变化的现象。转化现象的发现和转化因子的证实对促进现代分子生物学的诞生和发

2、展产生了巨大的推动作用。在实验室条件下，通常用CaCl2、cAMP、低温培养、PEG介导及电脉冲等方法转化细菌或其它微生物。细菌转化的过程大体可分为三个阶段：感受态的出现DNA的吸附和进入DNA的整合感受态的出现感受态（competence）：是指受体菌细胞最容易接受外源DNA并使之不被DNA酶降解的生理状态。一、转化过程和机制细菌细胞在特定时期产生一种称为感受态因子的小分子蛋白（5-10kD）。这种感受态因子可与细胞表面受体蛋白结合，使细胞产生感受态特异蛋白，其中包括细胞壁自溶素。自溶素使细胞表面的DNA结合蛋白及核酸

3、酶裸露出来，使其具有与DNA结合的活性。因此，当细菌表面出现许多DNA结合位点时，就意味着细菌出现了感受态。4.进入细胞的单链与寄主DNA同源区重组并整合到染色体上革兰氏阳性菌1.双链DNA片段在DNA结合蛋白（黑色点）的帮助下吸附到细胞表面并由核酸酶（紫色椭圆）切成缺口2.由核酸酶降解其中一条单链3.未被降解的单链与感受态特异蛋白相互作用并进入细胞DNA的吸附和进入在流感嗜血菌中，其感受态细胞形成一种结合双链DNA的膜结构，称为转化小体（transformasome）。该小体吸附DNA后，与细胞的内外膜相融合而转入细胞

4、内侧，再将双链变成单链DNA。转化小体双链DNA被转化小体摄取转化的双链DNA（30-50kb）结合到膜受体上很快进行同源重组使外源DNA整合到染色体上革兰氏阴性菌DNA在进入感受态细胞之前，要经过可逆性吸附和不可逆性吸附。可逆吸附的DNA对DNA酶敏感，并可以洗脱下来。随着感受态细胞膜蛋白的参与，可逆性吸附逐步向不可逆吸附转化，不可逆吸附DNA对DNA酶不敏感。吸附到细胞表面是双链DNA，而不是单链DNA实验证明：肺炎链球菌的转化因子在100℃下逐渐失去转化活性(DNA发生变性)。在逐渐冷却过程中活性逐渐恢复(单链DN

5、A复性成双链)。说明完整的DNA双链结构对于转化活性来说是必要的，转化的第一步，需要双链DNA才能结合到细胞表面的结合位点上。当DNA吸附后，被酶解开成单链DNA，只有单链DNA才能进入细胞内并与受体染色体DNA进行整合。流感嗜血菌特异性摄取序列：5’AAGTGCGGTCA3’淋病奈瑟球菌特异性摄取序列：5’GCCGTCTCAA3’在流感嗜血菌的染色体上有600个拷贝的摄取序列。摄取序列虽然只有10-12bp，但很少随机地出现在其他物种的DNA序列中，因此这些细菌对外源DNA的吸收具有选择性。为什么有些细菌对摄取的DNA

6、有特异性要求呢？近年来的研究表明，G-菌和G＋菌对单链DNA也能进行有效转化，但一般是在较低的pH值下进行的。外源DNA片段在受体细胞中的命运：外源DNA（红色）转化到受体细胞后，通过同源重组整合到染色体上，否则被降解成核苷酸。DNA的整合转化为相同或相近物种之间的同源重组提供了可能性，是自然界中基因交换的一条重要途径，在生物变异和进化中起着重要作用。转化的效率决定于下列三个内在因素：受体细胞的感受态，决定转化DNA能否进入细胞受体细胞的限制系统，决定转化DNA在整合前是否被分解供体和受体DNA的同源性，决定转化DNA的

7、整合。由于转化DNA总是与顺序相同或相似的受体DNA配合，所以亲缘关系越近的其同源性也越强，转化效率也越高。二、人工转化通过二价阳离子处理，大肠杆菌等部分G-细菌能产生感受态通过制备原生质，大多数细菌特别是某些G+细菌已知许多细菌包括大肠杆菌均无自然转化的能力，但经人工诱导可使它们形成感受态。如：1970年Mandel和Higa首先发现DNA在含有高浓度Ca2+的条件下能够被受体细胞摄入和转化，随后的实验证明由Ca2+诱导的人工转化的大肠杆菌中，其转化DNA必须是一种独立DNA复制子。大肠杆菌的转化随着研究技术的改进和经

8、验的积累，人们已经建立了用Ca2+、Mg2+等诱导转化的标准程序，能对大肠杆菌菌株C600、JMl01、JMl09、DH5a等进行有效的转化。先将大肠杆菌培养至OD600=0.5～1接着用50-100mmol／LCaCl2处理制备成感受态细胞然后将DNA与感受态细胞混合在冰浴中反应20-40min进行42℃热击可增加