植物组织培养过程.doc

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1、一、原理植物组织经过脱分化作用，形成愈伤组织，经过再分化作用，愈伤组织又能重新分化为有结构的组织和器官，最终形成完整的植株。早在1957年Skoog即发现培养基屮植物激素的类型和它们的比例，对再分化过程起着重要的作用。二、试剂与仪器设备（―）试剂?乙醇。?IAA或2,4-Do?HgCl2（或次氯酸钠）。?6-节基氨基腺嚓吟（6-BA）?MS培养基（见附录）。（二）仪器设备培养室，高压灭菌锅，水浴锅，解剖刀，三角烧瓶（IOOitiL）,烧杯，量筒，培养111L,棉线，接种箱或超净工作台，分析天平，长锻了，剪刀，容量瓶，移液管，牛皮纸。三、实验步骤1.配制培养基

2、（1）愈伤组织诱导培养基：MS培养基（蔗糖含量为10g/L,2,4-D含量为2mg/L,琼脂10g/L）o（2）试验培养基：在MS培养基屮按表33-1加入IAA和6-BAon引味乙酸先用少量0.1mol/LNaOH溶解，6-节基氨基腺I麋吩先用少量0.1mol/LHC1溶解，然后用蒸馄水稀释，再加入培养基屮。表33-1试验培养基'

3、«TAA和6-BA含量序号IAA（mg/L）6-BA（mg/L）相对比值2.培养基灭菌将配好的培养基加入琼脂加热溶解，调至pH5.8,趁热分装于100mL三角烧瓶屮，每瓶约20mLo待培养基冷却凝固后，用一层称量纸和一层牛皮纸包扎

4、瓶（管）口，并用棉线扎牢，然后在高压灭菌锅屮121°C（1kg/cm2）下灭菌20min。取出三角烧瓶放在台子上，冷却后备用。接种操作所需的一切用具（如长银了、解剖刀、剪刀等）及灭菌水，需同时灭菌。3.诱导产生愈伤组织（1）取健壮的烟草茎数段，每段约5cm长，于烧杯屮用0.1%氯化汞（升汞）浸泡20min,取出用无菌水洗3〜4次，置于无菌培养叽屮，在接种箱屮按无菌操作要求剥去外皮（接种箱事先用紫外灯灭菌30min）,用解剖刀切成5mm厚的圆片（弃去开始一片和最后一片），用长银子将它接种在诱导培养基上,注意圆片的切口朝向培养基，每瓶接种4片S接种后扎好瓶口。（

5、2）将已接入植物组织（外植体）的三角烧瓶，培养在25°C温室中，每星期检查1〜2次，剔除材料已被杂菌污染的三角烧瓶，3〜4周后产生愈伤组织。（3）选取愈伤组织生长良好的三角烧瓶，用解剖刀将愈伤组织切下，转移到含有不同激素的试验培养基中（也可以连同原来的外植体一起转移）,每瓶放1〜2块，仍培养在25°C温室屮，每周1〜2次观察不同处理的三角烧瓶屮，愈伤组织分化情况，肓至长出根和芽。长成的幼小植株即为“试管苗”，可移栽于花盆屮。植物组织培养发展简史植物组织培养是20世纪30年代初期发展起来的一项生物技术。它是在人工配制的培养基上，于无菌状态下培养植物器官、组织、

6、细胞、原生质体等材料的方法。植物细胞的全能性是植物组织培养的理论基础。20世纪初，曾有人提出能否将植物的薄壁细胞培养成完整植株?研究者从胡萝卜根的韧皮部取下一块组织，并在液体培养基中培养，使其分化出了愈伤组织，从愈伤组织乂得到胚状体，胚状体转移到固体培养基上继续培养后，获得了完整的胡萝卜试管植株。经过栽培，此植株能够正常生长并开花结果，其种子繁衍出来的示代与正常植株的种了所繁衍出的示代别无二致。根据此实验可以得出以下结论：即不经过有性生殖过程也能将植物的薄壁细胞培养出与母体一样的完整植株。由于植物的每个有核细胞都携带着母体的全部基因，故在一定条件下，它们均能

7、发冇成完整植株，这就是所谓的植物细胞全能性。科学家在植物激素对器官建成，及改进培养基配方等方面所取得的成果，极大地推动了组织培养技术的发展，使这项技术可以实际应用于快速繁殖、品种改良等方面。20世纪50年代初期，法国科学家利用组织培养技术成功地脱除了染病大丽花植株所携带的病毒，从而为脱毒苗的生产提供了一种可行的途径。现在凭借纟R织培养技术来脱除植物的病毒已经在生产屮广泛应用。20世纪50年代屮期，由于细胞分裂索的发现，使组织培养状态下外植体芽的形态建成成为可人为调控的因素，从而使在组织培养状况下进行植株再生成为现实。进入60年代以麻，纽•织培养技术在基础理论

8、、实际操作方面不断取得进展，相继在植物体细胞杂交、单倍体冇种、种质资源保存、快速冇苗、人T种了制造、次生代谢物生产等方面有了可喜的成果。时至今日，纟R织培养技术已经成为基础坚实、易于掌握、应用面广的一种技术手段。愈伤组织及其形成愈伤组织(callus)原指植物体的局部受到创伤刺激后，在伤口表面新生的组织。它由活的薄壁细胞组成，可起源于植物体任何器官内各种纽•织的活细胞。在植物体的创伤部分，愈伤纟R织可帮助伤口愈合；在嫁接屮，可促使砧木与接穗愈合，并由新生的维管纟R织使砧木和接穗沟通；在抨插屮，从伤口愈伤纟R织可分化出不定根或不定芽，进而形成完整植株。在植物器

9、官、组织、细胞离体培养时，条件适宜也可以长出愈伤组织