免疫组化步骤.doc

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1、免疫组化步骤1、烤片：放于60℃烘箱内，20-25min；2、脱蜡：二甲苯I、II、III，3次，5min/次；注：从烘箱中拿出迅速放入二甲苯中，防止蜡凝；3、复水：100%酒精---100%酒精---95%酒精---90%酒精---80%酒精---70%酒精---50%酒精，5min/次；4、ddH2O洗2次，5min/次；5、抗原修复：柠檬酸盐抗原修复液1x（迈新MVS-0100），125℃，5min；注：1x修复液：198mlddH2O+2ml抗原修复液100x,混匀；抗原修复高压锅的使用：确

2、定垫圈和导热片的放入，加入700mlddH2O，放入铁架固定切片盒，注意不要压到导热片，盖上锅盖检查排气嘴是否可以自由旋转，锅盖上的“close”对准白点，“open”所指处与边缘无缝隙，设置程序，开始；结束后等到排气口的红色指示消失即可打开锅盖；6、修复结束后冷却至室温（30min），1xPBS洗2次，5min/次；7、去除H202酶：3%H202，15min；注意遮光；注：用1xPBS稀释30%H202至3%H202（如5ml30%H202+45mlPBS50ml3%H202）8、PBS2次，P

3、BST1次，5min/次；9、封闭（blocking）：先将片子擦干，注意保持组织部分的湿润，再用专用记号笔沿距离组织3mm处画圈，然后加入封闭液，室温1h，湿盒；封闭液不要过多，以免溢出；注：封闭液：1xPBS，0.3%TritonX-100，10%goatserum（如：870ulPBS+30ul10%TritonX-100+100ul10%goatserum1ml封闭液）；1、孵一抗：用封闭液稀释一抗，不同的抗体稀释的倍数不同，4℃，过夜（有的抗体是室温1h），湿盒。对照组加不含抗体的封闭液；

4、注：拿到4℃冰箱时动作延缓慢，小心不要使一抗跑出圈外；加一抗前可以重新画圈，以免一抗外流；常用抗体的稀释比例：GFAP--1:200，Ki67--1:200，CD31--1:20~1:40，Flag--1:200，Nestin--1:200，III-Tubulin--1:10002、室温，30min；（从冰箱拿出时动作也要缓慢）3、PBST洗3次，5min/次；注：PBST：1L1xPBS+10ml10%TritonX-1000;4、①加荧光标记的二抗（封闭液稀释抗体1:1000），1h，室温，湿盒

5、；②加HRP标记的二抗（封闭液稀释抗体1:10000），室温30min;注：加二抗前可以重新画圈，以防二抗外流；5、PBST洗3次，5min/次；6、若①复染：DAPI染色，避光，5min；若②TSA放大3~10min,PBST洗3次，5min/次，再复染DAPI；注：DAPI：50uMDAPI用1xPBS稀释1000倍7、封片：直接向组织滴加抗荧光淬灭剂，注意不要产生气泡，盖盖玻片时也要注意不要产生气泡，避光4~5min后即可拍片。