原代神经元培养.doc

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1、神经细胞原代培养从动物（大鼠或小鼠等）的胚胎或新生动物的脑组织取下某一局部区域，分离细胞，培养在培养容器后不再移植，常称为原代神经细胞培养。一、培养前准备1.器械和器皿器械：外科剪、镊子、虹膜剪等、小剪刀、细镊子和虹膜小刀等各种金属器械如解剖器械，使用后及时刷洗干净，用酒精棉球擦拭后晾干，或经60℃烘干，以防生锈。由于湿热消毒对手术器械容易可用70－80％酒精浸泡1小时以上消毒。器皿：1)玻璃瓶及相应的胶塞或胶木螺旋盖，用于分装血清、多聚赖氨酸、解剖液、各种盐溶液和培养液等。2)培养瓶、盖玻片培养用的盖玻片必须不含铅、不

2、发霉，可用0.2N盐酸浸泡10分钟，用蒸馏水洗2次，每次10分钟，然后移入丙酮或乙醇浸泡10分钟，再用双蒸水洗2次，每次10分钟，烘干待消毒。凡组织学用过的旧盖玻片一般不用。3)移液管、吸管、烧杯、离心管和培养皿。4)塑料培养皿（35mm）、塑料培养板（6、24、96孔）。辅助工具：放置试管、吸管和玻璃瓶等的架子。2.培养基和培养用液的配制1)  培养基质：有多聚赖氨酸、牛皮胶原和鼠尾胶原。本室目前常用分子量为7-140000多聚赖氨酸（Poly-L-lysine，浓度为0.1mg/ml。2)  平衡盐溶液：主要以无机盐

3、和葡萄糖配制而成。各种平衡盐溶液主要的不同点在于NaCl的浓度、离子浓度及缓冲系统的不同，可根据实际需要选用适当的平衡盐溶液。3)  培养液：目前已有现成的干粉出售，按说明书进行配制即可。神经细胞培养需高糖，培养液应含有或加葡萄糖至6g/L。目前培养海马神经元可选用B27无血清培养液。4)  血清：有胎牛血清、小牛血清和马血清等。分装成小瓶，4℃保存备用（分装前需56℃灭活30分钟）。5)  胰蛋白酶溶液：用于分离细胞。先用少量灭菌三蒸水将胰蛋白酶粉末溶成糊状，然后补水至2.5%浓度，振荡摇匀，4℃过夜，待完全溶解后用滤

4、器过滤灭菌，并分装成1-2ml冻存。用前以D-Hanks平衡盐水或其他无钙镁离子溶液溶解稀释至0.25%或0.125%。实际使用温度一般为37℃20-30分钟。6)  解剖溶液：由平衡盐水（D1-无钙镁离子的Puck氏液）、HEPES缓冲液和蔗糖－葡萄糖溶液组成称为D1-SGH。D1平衡盐水：NaCl8.0g、KCl0.4g、Na2HPO4.7H2O0.045g、KH2PO40.03g、酚红0.0012g、三蒸水50ml。蔗糖－葡萄糖（SG）：蔗糖7.5g、葡萄糖3g、三蒸水50ml。HEPES（H，0.352mM）：用

5、25ml左右的三蒸水溶解2.35g的HEPES后，用NaOH或HCl调pH至7.3-7.4，加三蒸水至28ml。将D1、SG和H三者合在一起并稀释到1000ml即为解剖液，小瓶分装成5ml后置4℃备用。二、培养细胞操作1.  涂培养基一般在细胞培养前1-2天，将使用的塑料培养皿（35mm）、24孔、96孔培养板或消毒的盖玻片涂上一层Poly-L-Llisine，置于超净台中备用。2.  实验动物准备动物的年龄和取材部位对培养细胞的成活率关系密切，需根据具体实验而定。如大鼠海马细胞培养，以18天胚胎或新生48小时内的大鼠为

6、宜，而培养背根神经节与脊髓神经元以11-13天胚胎小鼠、大脑皮层以小鼠16-21天、小脑细胞取自临产或新生动物。3.  进入培养室操作1)  穿上消毒衣，戴上口罩和帽子。2)  安放消毒的实验用具，如培养皿、解剖器械、玻璃吸管、培养板等于桌面适当的位置。3)  将平衡盐水、解剖溶液、血清、胰蛋白酶等溶液放置于桌面上，同时准备一个冰袋和污物盘。4)  解剖动物以新生大鼠取海马组织为例：将新生大鼠投入80％的酒精中，消毒5-10分钟。用解剖剪断头，并移入玻璃器皿中，沿中间骨缝将头骨剪开（头骨外侧下沿也剪开），然后剥开头骨暴露

7、大脑半球，去脑膜，沿中线将大脑半球往外翻开，暴露内侧面半月状的海马组织。用弯头镊子轻轻夹起，放入解剖液内（培养皿可置于冰袋上）。待数个动物均解剖后，将培养皿内的海马组织移至解剖镜下，仔细去除血管、膜及非海马结构（取材干净非常重要）后，再移至小培养皿中，加数滴D1-SGH液，并用虹膜剪剪碎或用虹膜刀切成小粒。5)  在上述海马组织加入解剖溶液和0.25%胰蛋白酶各1ml，摇匀后置于37℃培养箱内消化25-30分钟。6)  将消化好的细胞碎片移入2ml的离心管中，吸去剩余的胰蛋白酶溶液，加入含血清的全培养液2ml终止胰酶作用

8、，约10分钟后，再更换一次全培养液以洗净胰酶。（全培养液成份为80％DMEM、10％胎牛血清、10％马血清或小牛血清，胎牛血清有助于细胞贴壁）。7)  用口径较小的、在火焰上光滑过的玻璃吸管吸取细胞团，移入另一离心管，加入2ml培养液并吹打20次。将离心管斜放，让细胞碎片下沉5-10分钟后，吸取上层细胞溶液约1ml。