猪伪狂犬病病毒（PRV-JL 株）的分离与鉴定.pdf

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1、2014第5期养猪SWINEPRODUCTION109猪伪狂犬病病毒(PRV—dL株)的分离与鉴定马兴杰，罗亚坤，崔尚金(中国农业科学院哈尔滨兽医研究所兽医生物技术国家重点实验室，黑龙江哈尔滨150001)中图分类号：$852．65文献标志码：A文章编号：1002—1957(2014)05—0109—04摘要从吉林某猪场疑似猪伪狂犬病发病仔猪的脑组织病料中分离出1株病毒，感染猪以后病理变化明显，经幼仓鼠肾传代细胞系(BHK一21)接种、毒价测定、病毒形态观察、PCR扩增及相关动物试验证实为猪伪狂犬病病毒(PRV)野毒，并命名

2、为PRV一儿。经BHK一21接种，病毒生长良好；毒价稳定，可达10-7．9／0．2mL；电镜负染观察到病毒粒子呈椭圆或圆形外观，无囊膜的病毒粒子直径约110～150nm，有囊膜的成熟病毒粒子直径约150～180nm；PCR鉴定该毒株为强毒，其gE序列与Genbank登录的PRVgE序列同源性为99％～100％；本研究构建了小鼠的感染模型，并进行了病毒载量检测，结果用不同剂量病毒培养物接种Balb／C小鼠，小鼠死亡明显，最初在其脑组织中检测到PRV病原，随后在肾、肺、心逐步检出，试验初步证实了PRV的脑组织嗜性。试验表明，PR

3、V—JL是1株强毒，对易感动物具有高致病性，为进一步开展该病毒流行病学、致病机理、疫苗免疫与诊断研究奠定基础。关键词猪伪狂犬病病毒；分离；鉴定2012年问，在北京、天津、吉林、山东以及河南均为进口或国产分析纯级试剂。等地区的大型猪场发现有大量疑似感染伪狂犬病1．2主要仪器病毒(PRV)的病例(An等，2013；隋慧等，2013)；在剖检所用器械；Eppendof6325ZP810878PCR河北的部分猪场也发现有母猪流产、死胎及木乃伊仪(Eppendof公司)；SYNGENE型凝胶成像系统胎的现象，还伴有初生仔猪大批死亡的情

4、况，后通过(GENE公司)；普通离心机(Eppendorf公司)；电热实验室检测证实为猪伪狂犬病；而后又在湖南、广东恒温水浴锅(DK一8K型，上海精宏实验设备有限公等地发现相似临床症状，该病隐隐有暴发的趋势(彭司)：一20oC低温冰箱(Themo公司)；电子天平金美等，2013)。早在2011年底，中国许多猪场在免KF2102型(龙腾电子有限公司制造)；DYY一8C型稳疫过PRV—Bartha—K61疫苗后仍发现有大量仔猪死压稳流电泳仪(北京市六一仪器厂)；一80℃超低温于猪伪狂犬病。我们在吉林也发现了类似现象，分冰箱(Th

5、emo公司)；DHP一9082电热恒温培养箱(上离到了1株病毒，现报道如下。海申贤恒温设备厂)；CavoY稳压稳流电泳仪(北京1材料凯元信瑞仪器有限公司)。1．1毒株、细胞和主要试剂1．3病料背景及来源PRV—Ba~ha—K61为本实验室保存；幼仓鼠肾病料由中国农业科学院哈尔滨兽医研究所猪流传代细胞系(BHK一21)由本实验室保存，用于伪行病学实验室采集于2012年12月，来源于吉林某狂犬病病毒的增殖；DMEM购白GIBCO公司；DL大型猪场临床症状疑似为感染PRV的发病仔猪22000DNAMarker购自宝生物工程(大连)

6、有限公头及木乃伊胎4头。发病仔猪为5～7日龄，表现如下司；纳米PCR试剂盒购自山东大正医疗器械股份有临床症状：体温升高、精神委顿、重度消瘦、运动不协限公司；血液／组织／细胞基因组DNA提取试剂盒购调、发抖、痉挛等。而母猪和肥育猪表现正常，这可能白天根生化科技(北京)有限公司；胶回收试剂盒为因为它们已经接种过PRV疫苗。病料采集后常规研Axygen公司产品；无菌血清购白德国BIOCHRO—磨处理，分离后的心、肝、脾、肺、肾和脑组织保存MAG公司；细胞培养液为GIBCO一1640，含8％的灭于一20℃冰箱中。活胎牛血清、青霉素和

7、链霉素各100U(1a,g)／mL；琼2方法脂糖为Spanish公司产品；其他试验中用到的试剂2．1发病猪的病理剖检剖检前将剖检所用器械全部高温消毒，并置于收稿日期：2014—07—25作者简介：马兴杰(1988一)，男，山东临沂人，在读博士研究生，主紫外灯下过夜灭菌；病猪剖检前询问畜主病猪日龄、要从事猪伪狂犬病病毒流行病学及载体疫苗的研究．品种、体重、疫苗免疫史等信息，观察仔猪皮毛光泽E-mail：mxjsdau@163．corn通讯作者：崔尚金，研究员，博士生导师．E-mail：cuishangjin@126．com度及

8、精神状态、眼睑、鼻孔、耳朵等各天然孔部位患1l2养猪SWINEPRODUCTION(5)2014PRV—HeN1)，该病毒可以引起猪的高烧、拉稀、走路价测定、病毒形态学观察、PCR鉴定、序列分析、小打颤、原地转圈等明显症状。病毒分离后针对该病鼠模型等方法，证实分离到了1株PRV野毒株并命毒