基因组编辑TALEN&CRISPR比较.pdf

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1、基因组编辑TALEN&CRISPRGeneCopoeia复能基因大纲基因组编辑TALEN&CRISPR-Cas9基因组编辑解决方案基因组编辑应用2基因组编辑TALEN&CRISPR-Cas9基因组编辑解决方案基因组编辑应用3生物学研究需要从逻辑上验证基因的功能该基因表达时，呈现某种功能该基因被敲除时，该功能消失或下降该基因恢复时，该功能得到恢复终极目标：随心所欲的基因操作基因敲除替换启动子破坏阅读框基因敲入核苷酸置换miRNA调控修饰基因标签蛋白质截断更多……其他常用的基因操作技术Genetrap、化学诱变、转座子:随机性、海量筛选

2、RNAi：不完全敲除、临时性表达克隆瞬时转染：操作简便、临时性病毒介导的整合：整合位点不特异、潜在风险高自杀质粒，同源重组：效率低（~1HR/106cells）6DSB*介导的靶向基因组编辑*DSB：DNA双链断裂**NHEJ:非同源末端链接***HR：同源重组位点特异性核酸酶NHEJ**HR***7锌指核酸酶（ZFN）Carroll(2011).Genetics188,773技术：限制：融合蛋白：DNA结合域融合限制性内部分三联碱基对尚未发现对应锌指切酶有上下文依赖，影响特异性锌指模块识别三联碱基对需大量时间及成本进行优化和筛选以二聚体起作用生成的DS

3、B被NHEJ及HR修复8基因组编辑TALEN&CRISPR-Cas9基因组编辑解决方案基因组编辑应用9来源TALECRISPR-Cas自植物病原体黄单胞菌属来自细菌及古细菌针对外源DNA序列的适应性免疫系统靶点识别模式TALECRISPR-Cas9类转录激活因子效应子细菌适应性免疫系统蛋白质-DNA识别RNA-DNA识别TALE的识别模式TALE类转录激活因子效应子蛋白质-DNA识别每模块特异识别1个碱基对识别模块序列高度保守，含约34个氨基酸模块第12,13位氨基酸可变，与DNA靶点碱基有一一对应关Bogdanove&Voytas(2011).Ge

4、netics333,1843系CRISPR-Cas9的识别模式CRISPR-Cas9体系RNA-DNA识别crRNA识别长约20bp的靶点，并与tracrRNA结合靶点序列末端需有5’-NGG-3’PAM*Cas9具有核酸酶活性，能识别PAM，结合并剪切crRNA&tracrRNA识别的靶序列，生成DSB*PAM:protospaceradjacentmotif前间区序列邻近基序应用模式TALECRISPR-Cas9类转录激活因子效应子细菌适应性免疫系统TALENCRISPR-Cas9TALE-TFTALENTAL效应核酸酶TALE结合域融合FokI核酸酶功能域

5、一对TALE分别特异识别并结合靶点两侧的结合位点一对TALEN的FokI形成二聚体切割靶点，生成DSB理论上可识别任意的物种、细胞及序列TALE-TFTALE转录激活因子TALE结合域融合VP64转录调控功能域TALE特异识别并结合位于目标基因启动子区的靶序列VP64结合其他因子形成转录复合结构，启动目标基因转录理论上可识别任意的物种、细胞及序列TALE的应用模式将识别靶标DNA序列的TALE与不同的功能域蛋白融合，实现不同的靶向基因操作ActivatorsNucleasesRepressorsMethylasesRecombinase激活基因的转录——T

6、ALE-TF抑制基因表达——TALE-TR启动子附近的甲基化——TALEM特定序列进行切割——TALEN特定序列的重组酶——TALER其他……CRISPR-Cas9crRNA&tracrRNA融合为sgRNA，简化构建Cas9具有核酸酶活性，能被PAM，crRNA&tracrRNA引导至靶点，生产DSB几乎能靶向任意细胞及序列能同时靶向多个靶点18CRISPR-Cas9的应用模式对Cas9序列进行突变，与不同的功能域蛋白融合，实现不同的靶向基因操作Cas9无核酸酶活性的Cas9核酸酶(dCas9)突变使核酸酶功能域失活*Cas9与不同的功能域蛋白融合切口

7、酶基因组编辑基因组调控基因组成像DNA剪切转录抑制调控因子定位荧光标签定位优点TALENCRISPR-Cas9无基因序列、细胞、物种限制序列、细胞、物种限制少一对一识别，实验设计简明准确RNA-DNA识别，实验设计灵活简易识别区更长，特异性高，脱靶效可同时进行多靶点操作，适用应低于高通量实验具有ZFN相等或更好的活性，实克服甲基化敏感的问题，实验验周期短，成本低效率不低于ZFN及TALEN无需重复构建融合蛋白，实验周期短，成本低技术限制TALENCRISPR-Cas9需重复构建融合蛋