细胞培养技术.doc

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1、细胞培养技术%1.细胞培养的基本原理%1.细胞培养的基本设备与用品%1.细胞培养用品的清洗与消毒灭菌清洗1•常用玻璃器皿清洗2.橡胶制品的清洗3.G6除菌滤器的清洗4.正压除菌滤器的清洗5.塑料制品的清洗6.清洗液的配制消毒灭菌1.湿热消毒2.干热消毒3.紫外线消毒4.滤过消毒5.消毒剂6.塑料器皿消毒7.电离辐射消毒%1.细胞培养用液的配制与除菌1.蒸憾水的制备2.平衡盐溶液（balancedsaltsolution,BSS）的配制3.天然培养基4.合成培养基5.血清细胞培养基6.无血清细胞培养基7•消化液1.pH调整液2.200毫摩尔/升L—谷氨酰胺3.抗菌素液4.细胞用液的分装方

2、法和耍求…•细胞培养的基本原理细胞培养是用酶消化法将组织碎块分离成单个细胞，用培养基制成细胞悬液，在体外适宜条件下，使细胞生长繁殖，并保留英一定的结构和功能特性。细胞培养与组织培养、器官培养主要不同点在于原始培养的对象不同。细胞培养使用的是单个细胞悬液，组织培养使用的是组织块（0.5〜1立方毫米）或薄片（厚0.2毫米），而器官培养使用的是器官原基或器官的一部分或整个器官。在组织培养屮，细胞自组织块周围移出并生长，细胞在生长过程中总有移动（运动）或英它变动，这样就使被培养的组织难以长期维持其原有的结构和功能。培养时间越长，发生变化的可能性越大，结果常使单一类型的细胞保存下来，最终成了细胞

3、培养。在细胞培养屮，细胞生命活动和体内细胞一样，仍然是相互依存的，呈现一定的组织特异性，所以组织培养和细胞培养实际上无严格区别。但细胞培养方法也存在不足Z处：培养细胞失去体内细胞的制约和幣体的调节作用，细胞形态和功能会发生一定程度的改变。培养方法、实验试剂对细胞形态和功能有一定的影响，如胰蛋白酶可破坏细胞表面受体、酶、抗原等。长期体外培养的细胞，由于反复传代、冻存和操作等因素的影响，可能发生染色体非整倍体改变，呈永生化或癌变的特征。二•细胞培养的基本设备与用品（1）细胞培养的基本设备细胞培养的基本设备有：C02培养箱，倒置显微镜，净化台，压力蒸汽消毒器，自动双重纯水蒸憾器，液氮罐，冰箱

4、，电热干燥箱，电热恒温培养箱，电动吸引器，抽气泵等。（2）常用的实验用品1.玻璃器皿细胞培养所用的玻璃器皿应由透明度好、无毒的中性硬质玻璃制成。常用的有以下几种：国产螺旋口培养瓶［有12.5毫升，25毫升，100毫升等规格，国外培养瓶常以底面积（平方厘米）表示］;培养皿（直径冇3.5厘米，6厘米，9厘米，10厘米等规格）；离心管（5毫升，10毫升）；注射器（1毫升，5毫升等）；用生理盐水瓶代替的贮存瓶（100毫升，250毫升，500毫升）；青霉素瓶（5毫升）；西力辛瓶（10毫升）；其它还有尖吸管和移液管，载玻片（厚度0.8-1.2毫米），盖玻片（厚度0.12毫米），贮存尖吸筒用的玻璃筒

5、或金属筒，漏斗，烧杯，量筒，贮蒸憾水瓶，冷冻管（1・5毫升，2毫升）等。1.塑料品多孔培养板规格有4、6、12、24、96孔等，培养1111直径有3厘米、6厘米、10厘米等。塑料品经消毒灭菌密封包装，供一次性使用，重复使用的需经特殊方法清洗消毒。犁料器材厚薄均匀，有的表面经特殊处理，细胞易于生长。2.器械解剖刀、眼科剪和银（直头和弯头）、中号圆头锡、止血钳等。3.杂用品金属饭盒、试管架、各种规格胶塞、记号笔、塘瓷盘、吸头（吸取液体的胶帽）、酒精灯、酒精、碘酒棉球瓶、火柴等。组织培养中使用最多的是吸管、培养瓶、培养皿及各种瓶塞。实验者手中应有三套器材，瓶塞数要大于瓶数，才能保证实验中的循

6、环使用。三•细胞培养用品的清洗与消毒灭菌（1）清洗1.常用玻璃器皿清洗◊清洗耍领浸泡初次使用的玻璃器皿呈碱性，表面常附有灰尘和一些对细胞有毒的物质，如铝和碑等。空气湿度高时，玻璃器皿表面又易长霉。使用前，新器皿浸泡在5%稀盐酸中过夜，以中和玻璃表面的碱性物质并去除霉斑；然后经简单刷洗，流水冲洗（逐片进行），蒸憾水浸泡，干燥备用。新玻片处理后，短时间不用时，需将它投入95%的酒精中保存，以防玻片长霉。培养后的玻璃器皿应立即投入清水中浸泡，器皿屮残留的细胞、蛋白质一旦干涸，即固着于玻璃表面，极难脱落。刷洗用过的玻璃器材经自来水冲洗后，浸入水屮煮沸，然后将适量洗涤剂（洗洁精或洗衣粉）投入沸水

7、中继续煮沸10分钟，趁热刷洗器皿内外，刷洗后浸入清水中进行冲洗。酸泡刷洗好的玻璃器材干燥后置清洁液中浸泡24小吋,清洁液的强氧化作用可清除刷洗不掉的极微量杂质。O清洗步骤玻璃器材煮沸10分钟一刷洗一流水振荡冲洗15・20遍一50°C烤干一清洁液浸泡24小时一流水振荡后冲洗15-20遍〜漓水〜蒸幅水浸泡2次（每次24小吋）-*50°C烤干，待包装。O清洗注意事项和耍求%1使用后的实验器材应立即投入清水中。%1浸泡、煮沸、酸泡的器皿内耍充满液体，不