环境微生物菌种鉴定.ppt

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1、企业生产过程微生物污染控制实例分析--无菌制剂生产过程微生物菌库的建立和种属鉴定辽宁省食品药品检验所抗生素室张亚杰2012.5一、立项目的二、采样方案三、试验材料及仪器设备四、鉴定方法五、鉴定结果六、结果分析七、讨论（1）为了了解无菌制剂生产过程中微生物污染情况，即微生物种类及分布情况，实现生产环境微生物、操作过程微生物与药品中污染微生物的比较和溯源分析，以便达到生产过程微生物实时有效动态控制目的。从而满足药品GMP对无菌制剂生产过程中微生物污染的监测和控制要求。（2）生产企业也可以利用这些数据，对无菌制剂

2、生产过程进行微生物风险评估。一、立项目的1.采样区域的确定2.采样对象及方式的确定3.采样频次的确定二、采样方案根据车间的面积、房间数，考虑到可能影响到产品质量的关键区域及易于受到微生物污染的关键部位的分布，设定了监测点及采样方案。企业按照中国新版药品GMP的要求，将洁净区划分为A级（动态100级）、B级（静态100级）、C级（10000级）、D级（100000级）。微生物采样点分布图见图1和图2。其中一车间采样点共39个，二车间采样点共98个。1.采样区域的确定1.采样区域的确定（一车间）1.采样区域的确定

3、（二车间）人员：手套印记表面接触（头、胸、手腕、肘、膝盖）环境：沉降菌（A级、B级、C级）浮游菌（A级、B级）2.采样对象及方式的确定企业根据生产情况和制剂车间的使用频次按季度制定采样频次，共收集4个季度的样本。3.采样频次的确定1．样本来源2．培养基3．仪器设备4．试剂试药三、试验材料及仪器设备1．样本来源无菌制剂一车间和二车间286份样本2．培养基胰酪胨大豆琼脂培养基（TSA），批号：1221965，BD公司；麦康凯琼脂（Mac），批号：1108423,BD公司；MRS琼脂，批号：100915，北京陆桥技

4、术有限责任公司三、试验材料及仪器设备3．仪器设备全自动微生物生化鉴定仪（Viteck2Compact）：法国生物梅里埃公司；麦氏浊度比浊仪：法国生物梅里埃公司；BX41光学成像显微镜：日本奥林巴斯公司；卡玛薄层色谱成像仪:瑞士CAMAG卡玛公司。APIRP三、试验材料及仪器设备4．试剂试药革兰氏染色液：青岛高科园海博生物科技有限公司；GN鉴定卡、GP鉴定卡、BCL鉴定卡、YST鉴定卡、ANC鉴定卡：法国生物梅里埃公司。APIRP三、试验材料及仪器设备鉴定流程图四、鉴定方法1.菌种的纯化与复壮采集的微生物可能在

5、物理的、化学的消杀条件下暴露了较长时间，菌株本身可能存在一定的损伤和变异，有必要对送检菌株进行复壮和再次纯化。首选的复壮及纯化培养基为胰酪胨大豆琼脂培养基（TSA）;对于革兰氏阴性菌，在无法与革兰氏阳性菌区分的情况下，也会选择MaC琼脂作为纯化培养基；对于较难培养的菌株，也采用血平板、改良MRS琼脂等进行纯培养。四、鉴定方法四、鉴定方法短小芽孢杆菌溶血葡萄球菌四、鉴定方法施氏假单胞菌四、鉴定方法2.革兰氏染色及镜检表皮葡萄球菌四、鉴定方法2.革兰氏染色及镜检缓慢芽孢杆菌四、鉴定方法2.革兰氏染色及镜检施氏假单

6、胞菌四、鉴定方法3.生化鉴定（1）采用全自动微生物生化鉴定仪（Viteck2Compact），根据革兰染色结果选择鉴定卡。（2）将24小时培养物，用0.45%无菌氯化钠溶液制备一定浊度的菌悬液，将64个生化反应集成到Viteck鉴定卡上，一般2-10小时左右给出鉴定结果。（3）结果判断：相似度96%-99%为极好，95%-92%为较好，91%-89%为好，88%-85%为可以接受，85%以下的相似度为低分辨率的鉴别。对于只鉴定到属的鉴别，还需根据提示信息进行补充试验，进一步甄别到种。四、鉴定方法（一）人员环境

7、总体结果一车间：110株其中：人员67株环境43株二车间：182株其中：人员133株环境49株总计：292株，其中阳性球菌109株（37.3%）阳性芽孢杆菌114株（39.0%）阳性无芽孢杆菌22株（7.5%）阴性杆菌39株（13.4%）2010-122010-12-1五、鉴定结果(二)不同区域结果—一车间主要区域五、鉴定结果分装灌装区（B级）人员环境金黄色葡萄球菌溶血葡萄球菌头状葡萄球菌蜡样/蕈状/苏云金芽孢杆菌泛菌属少动鞘氨醇单胞菌,短小芽孢杆菌花域芽孢杆菌解淀粉/萎缩/枯草芽孢杆菌缓慢芽孢杆菌解淀粉类芽

8、孢杆菌变异库克菌等溶血葡萄球菌腐生葡萄球菌木糖葡萄球菌表皮葡萄球菌人葡萄球菌藤黄微球菌/里拉微球菌苏云金芽孢杆菌少动鞘氨醇单胞菌嗜麦芽寡养单胞菌巨大芽孢杆菌等(二)不同区域结果—一车间主要区域五、鉴定结果调剂区（C级）人员环境人葡萄球菌/腐生葡萄球菌溶血葡萄球菌表皮葡萄球菌科氏葡萄球菌科氏亚种苛养颗粒链菌/藤黄微球菌/里拉微球菌藤黄微球菌/里拉微球菌施氏假单胞菌缺陷短波单胞菌/泡囊短波单胞菌泛菌属浅