酵母菌感受态制作及转化.doc

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1、Y187酵母感受态制作及转化1）挑新鲜单菌落Y187于8mlYPDA培养液，30℃，250rpm培养16-18h；2）至OD600＞1.5，1：10转接，此时OD600≈0.3；3）30℃，250rpm，4-7h，每2h检测一次，直到OD600=0.4-0.6；4）转入2个50ml离心管，5100rpm,5min,弃上清；5）加入1/2VddH2O,洗涤细胞，5100rpm,5min,弃上清；6）每管中分别加1ml1×TE/LiAc，冰上混匀，10000rpm，15s，去上清；7）每管中分别加0.5ml1×TE/LiAc，冰上混匀，10000

2、rpm，15s，去上清；8）每管中分别加0.5ml1×TE/LiAc，冰上混匀，10000rpm，15s，去上清；9）每管中分别加0.4ml1×TE/LiAc，每管100ul分装；10）分别加入100ng左右DNA（plasmid）和0.1mg鲑鱼DNA（10mg/ml,10ul）,移液器抽吸混匀溶液；11）分别加入600ulLiAc/PEG，高速混匀（10s-1min内）；12）30℃摇床恢复30min；13）超净台（无菌条件下）加入70ulDMSO,轻轻颠倒混匀；14）42℃热激15min；15）冰上放置1-2min；16）14000rp

3、m,15s,去上清；17）300ulTE重悬细胞；18）100ul/1ul分别涂布于YPDA平板；100ul/1ul分别涂布于SD/-Trp单缺陷平板；100ul/1ul分别涂布于SD/-Trp/-His双缺陷平板上，30℃倒置培养48-72h可见转化菌落。