农杆菌介导microRNA1510a基因转化大豆的初步研究-论文.pdf

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1、农业与技术第33卷第7期2013年7月农杆菌介导microRNA1510a基因转化大豆的初步研究王莉(吉林省长春市种子管理站，吉林长春130000)摘要：MicroRNA(miRNA)是生物体内普遍存在的、内源的、非编码的小分子单链RNA，并被证明在植物抵抗生物和非生物胁迫中起着重要作用。MiRNA1510a是课题组前期从大豆逆境胁迫miRNA表达谱中挑选出的表达量明显上调的一个小RNA。本研究在构建miRNA1510a表达载体基础上，以大豆品种吉育72为材料，利用农杆菌介导的子叶节遗传转化法将miRNA1510a基因转入大豆中。通过PCR检测，最终确定有

2、3株阳性植株，转化率为1．5％。该结果表明miRNA1510a基因已成功转入大豆，为进一步分析miRNA1510a调控大豆抗逆的分子机制奠定了基础。关键词：大豆；nfiRNA1510a基因；农杆菌介导法；PCR检测中图分类号：$565．1文献标识码：A1前言a农杆菌的培养：取出保好的菌液10～15l，加入50m11．1大豆的概述YEP液体培养基中，放置于28't2，180rpm摇床，过夜培养。大豆，是最重要的高蛋白油料经济作物之一，但大面积盐将菌液加入到50ml离心管中，置于离心机中4500rpm，离心碱、干旱土地的存在严重影响到人类对大豆这种农业经济作物

3、20min，倒掉滤液，保留沉淀，用共培养液体培养基溶解沉淀，的需求。所以利用基因工程手段改良大豆的耐盐碱、干旱性状，用于转化。达到利用盐碱、干旱土地的目的已经成为当前研究热点。b农杆菌侵染及子叶节转化：用灭菌后的刀和镊子将萌发1．2microRNAs的概述充分的大豆外植体切开，在下方接近生长点处垂直于外植体边MicroRNA(miRNA)是一类在生物体内普遍存在的、内缘轻轻划几下，外植体在远离生长点去弃去1／3备用。将切好源的、非编码的小分子单链RNA，长度约为21～24nt。的外植体倒入分装好的农杆菌液体中，侵染20～30rain。1．3植物遗传转化方法

4、共培养：取出侵入农杆菌的大豆外植体，放置于装有无现代生物技术的研究和发展为通过基因工程改良植物品系菌滤纸的平板上，吸干多余附着的农杆菌。将共培养培养基上提供了必要的前提，目前应用于大豆遗传转化的方法主要有基放入无菌滤纸，然后用灭菌后的镊子将大豆外植体生长点附因枪转化法、农杆菌介导转化法、花粉管通道法、病毒介导转近划有刀口的一面朝下，放置于无菌滤纸上，封口，暗培养化(瞬时转染)、脂质体介导原生质体转化等『l】。其中应用的2～3d。最广泛的是基因枪法和农杆菌介导法。农杆菌介导的遗传转生芽及芽伸长培养：共培养2—3d后，在超净丁作台中，化方法，是利用根癌农杆菌对

5、植物的侵染特性从而把外援基因用灭菌后的镊子取出大豆外植体，将生长点附近划有刀口处朝导入植物基因组的方法。因为其拷贝数低，整合完整，遗传比下，45。角倾斜将外植体插入加有lOmg／L的BASTA和500mg／较稳定，受目的基因分子量的影响较小以及操作简便，广泛的L的头孢霉素的生芽培养基中，封口，光照培养待生长点处长应用于植物的遗传转化卅。出子叶。观察在含有BASTA的生芽培养基中，存活下来的植株，2实验材料和方法就是具有抗BASTA抗性植株。21实验材料生根培养：等到外植体生长点处的真叶完全长成，不定2．1．1植物材料选择芽长至lcm以上时，可以将生芽培养的

6、外植体转移到生根培大豆品种为吉育72。养基中，放置于24cc／20℃16h光照的环境中培养15d左右，2．1．2酶与化学试剂待长出不定根。DNAMarker购自TaKaRa公司，根癌农杆菌EHA105由本炼苗及移栽：待再生植株根系计较发达时，从培养基中实验室自己提供。将其拿出，移栽到灭菌后的蛭石和土壤的混合土花盆中，若获2．2实验方法得转基因植株，可用于后续的分析实验。2．2．1农杆菌介导miRNA1510a基因转化大豆2．2．2转基因大豆初步检测2．2．1．1大豆转化具体过程提取转基因大豆基因组DNA，进行PCR检测，PCR扩无菌受体制备：用吉育72大豆

7、种子用次氯酸钠与盐酸进增产物用1．0％浓度的琼脂糖凝胶电泳进行检测，初步确定行过夜灭菌消毒处理。miRNA1510a基因已转人大豆中。种子萌发培养：将灭菌消毒好的大豆无菌外植体放置于2．2．2．1大豆基因组DNA的提取装有无菌水的玻璃器皿中浸泡20～30min，放人无菌培养皿中利用TPS法快速提取植物DNA：剪取新鲜大豆叶片2备用。暗培养3～7d。cm，放入1．5ml的离心管中，加入400lTPS提取液，用lml农杆菌侵染子叶节枪头捣碎。将捣碎的叶片放人75℃水浴20min。12000rpm离10AGRICULTUREANDTECHNOLOGY农杆菌介导m

8、icroRNA1510a基因转化大豆的初步研究王莉心lOmin。将