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1、小鼠肝细胞原代培养、灌注小鼠肝细胞原代培养+灌注我把我整理和收集战友的一些资料供你分享：材料：小鼠器具：饭盒、纱布、小剪子、小辍子、大銀子、大烧杯、平皿、研磨玻片、滤网、离心管(15/50ml)>6孔培养板、吸管、移液管、手套、微量加样器试剂：DMEM(含血清)、无血清DMEM培养基、胰酶、PBS准备：酒精擦拭台面后把物品摆放好，开紫外线灯照30分钟后开鼓风机吹至实验结束。操作步骤：1>将小鼠断颈致死，置75%酒精泡2・3秒钟，取肝脏，置于盛有PBS的平皿中。2、剔除脂肪、结缔组织、血液等杂物，转移到另一个盛有P
2、BS液的平皿中。3、用手术剪将脏器剪成小块(lmm2),玻片研磨，转到离心管，离心lOOOrpm,5mino4、视组织或细胞量加入5・6倍(3・5ml)胰酶，37°C中消化20分钟,每隔5分钟振荡一次，或用吸管吹打一次，使细胞分离。5、加入3・5ml含血清的培养液以终止胰酶消化作用。6、用100目孔径滤网滤过，除去未消化的大组织块。7、lOOOrpm,离心5分钟，弃上清液。8、加入无血清培养液5rr）l,冲散细胞，再离心一次，弃上清液。9、加入含血清的培养液l・2ml（视细胞量），血球计数板计数。20、将细胞调整
3、到5X105/ml左右，转移至6孔培养板中，37°C下培养。肝细胞生长不良涉及到细胞的取材、分离、纯化、培养条件，现分别介绍如下，首先介绍原代肝细胞的分离。目前肝细胞的分离主要采用经典的改良的Saigon经门静脉插管两步灌流法分离肝细胞。具体操作步骤如下：1：供体肝脏的游离：选择Mercedes手术切口，即人字型切口，进入腹腔，暴露肝脏，分离肝脏镰状韧带、左、右三角韧带（为了便于手术,可以用生理盐水纱布将肝脏轻柔的向下牵引，并向两侧移动，显露膈下空间），解剖肝十二指肠韧带，确认胆总管，应尽可能靠近远心端结扎（从十
4、二指肠后面进行）。分离肝动脉，确认胃十二指肠动脉，并将其仔细结扎，但切勿影响肝动脉腔。追踪肝总动脉的行程，直至脾动脉、胃左动脉显露，结扎离断脾动脉、胃左动脉注射肝素lOOUo缝扎胃左静脉以及来自胰腺的第一分支，以获取足够长度的门静脉。在胰腺颈部分别用力行两道结扎，并于结扎线间将英离断,这样就可显露脾静脉与肠远心端离断肝上下腔静脉，准备肝脏灌注。迅速切除肝脏，术屮连同肝上下腔静脉周围膈肌组织缘一并切除以移动肝脏，最终将肝脏在腹膜后切除，获取肝脏。之后行门静脉插管，准备行肝脏灌注，分离肝细胞。2:灌注液的配置:Per
5、fusionSolution1(g/L)：NaCL8.000NaH2PO4?2H2O0.078KCL0.400Na2HPO4?12H2O0.151NaHCO30.350EDTA0.190HEPES2.380Glucose0.900磁力搅拌器使固体成分充分溶解，用IMHCL或IMNaOH调定pH7.2〜7.4(使用pH计)，0.45及0.22双层滤膜负压过滤除菌，4°C保存，使用时液体温度维持在37°C(应用水浴箱)。PerfusionSolution2(g/L)：NaCL8.000KCL0.400CaCL20.5
6、60NaH2PO4?2H2O0.078Na2HPO4?12H2O0.151HEPES2.380NaHCO30.350CollagenaseIV0.500搅拌器使固体成分充分溶解，4°C冰箱过夜，以后同上。4:灌注步骤：4.137°CPerfusionSolution1沿门静脉插管灌注肝脏,流速20—30ml/min,灌洗lOmin左右,至肝脏呈现灰白色为止4.2Hanks液80ml短时间灌注，约2min,冲出EDTA4.337°CPerfusionSolution2沿门静脉插管灌注肝脏，流速20mL/min,灌洗
7、lOmin左右，循环使用4.4肝脏变软，塌陷后用无菌锡钝性分离肝细胞，去除肝包膜及血管等结缔组织，将含冇胶原酶的肝细胞悬液放入250ml无菌烧杯中(杯口用无菌锡纸包裹)，37°C水浴5min4.5加入无指示剂的DMEM基培，双层无菌纱布过滤4.6将滤液放入50ml离心管中，应用无指示剂的DMEM基培，4°C、50g>3min洗涤肝细胞3次5:获得的细胞经过以下的纯化，应用特定的培养基培养。提供几篇文章1.Klaunig,J.E.,Goldblatt,P.J.,Hinton,D.E.,Lipsky,M.M.,Cha
8、cko,J.,andTrump,B.F.(1981).Mouselivercellculture1.hepatocyteisolation.INVITROVol.17.No.10October,913-925・2.Kreamer,B.L.,Staecker,J.L.,Sawada,N.,Sattler,G.L,Hsia,M.T.S.,andPitot,H・C・(2986)
