全长cdna文库及构建方法与应用进展

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1、重庆医学2011年6月第4O卷第16期1639·综述·全长cDNA文库及构建方法与应用进展韩慧霞综述，陆洪光，王鲁审校(1．贵阳医学院附属医院皮肤科，贵州贵阳550004；2重庆市第一人民医院皮肤科关键词：DNA，互补；基因组文库；实验室技术和方法doi：10．3969／j．issn．1671-8348．2011．16．034文献标识码：A文章编号：16718348(2011)161639—04互补DNA(complementaryDNA，cDNA)文库是指生物不的文库在建库效率、全长比例和代表性等方面都有所提高，；。同生长发育时期，特定组织或器官所转录的全部m

2、RNA经反2004年Clepet等用TDNA连接酶替代TRNA连接酶，转录形成的eDNA与载体连接后形成的克隆的集合，cDNA文在一定程度上提高了寡核苷酸mRNA的连接效率，提高了文库是在基因组水平上研究某一生物特定器官、组织和发育时期库全长比例。同年Ota等用此法完成了21243条日本人基因表达的前提和基础。全长cDNA文库是生物体内完整cDNA文库的构建和测序，所构建文库中大约有85的克隆的mRNA分子反转录而获得的DNA分子群集，是mRNA分为全长。Kim等改良此法，提出RNA连接酶介导的cDNA子群的一个完整的拷贝。全长cDNA文库不仅提供完整的末端快速

3、扩增(RNAligase—mediatedrapidamplificationofcDmRNA信息，而且可以通过基因序列比对得到mRNA剪接信NAends，RLM～RACE)。2006年Sunderland等[。用RIM—息，此外，还可以对蛋白质序列进行预测及进行体外表达和通RACE确定拟南芥LIG1基因所有可能的转录起始位点。过反向遗传学研究基因的功能等。全长cDNA文库的优点2009年Tsuchihara等一将Oligo—capping法与大规模平行测明显，克隆大部分是全长的，有效提高了基因测序和生物信息序技术结合，提出以高通量方式收集转录起始位点(tran

4、scrip—学分析的进程，利于后期蛋白质表达及功能分析。目前几乎所tionstartsites，TSS)信息和定量分析转录物表达水平的方法。有构建全长eDNA文库的方法都是基于真核生物完整mRNA改良后的Oligocapping法被广泛用于实验研究。SumioSuga—的一个共同特征一一“帽子”结构，即mRNA的5端存在的no实验室利用此法不断完善人类基因转录起始位点数据库和mGpppNp结构。多数eDNA文库构建过程大致为分离总全长cDNA文库，通过对选定人类和小鼠cDNA5端的测序，RNA，纯化tuRNA，反转录成cDNA，然后与两端带有限制性获得3．3亿新

5、标签E1]。酶切位点的人工接头相连接，并将其插入到载体中，转染大肠2SMART法杆菌，得到cDNA文库。近年来全球众多学者一直在有计划、RN『A反转录5末端交换机制(switchingmechanismat5大规模地进行一些重要模式生物的全长cDNA文库的构建及endofRNAtranscript，sMART)是在第一链合成时使用专利研究，如拟南芥、水稻、果蝇、小鼠及猪等]，这些生物全长SMARTIV寡核苷酸产生大量全长双链cDNA。此法是在cDNA文库已构建完成，得到大量有重要价值的数据。本文主PCR基础上利用sMARTscr

6、heMMIV反转录酶的末端转要介

7、绍几种比较常用的全长cDNA文库的构建方法及其应用移酶活性及限制性内切酶SfiI的特性，快速构建全长cDNA进展。文库。sMARTscr．he”MMIVRT是由小鼠白血病病毒1Oligocapping法(moloneymurineleukemiavirus，MMLV)反转录酶点突变而该法最早由Maruyama和Sugano于1994年建立。它利获得，无RNaseH活性。当反转录到达tuRNA的5端时，RT用完整的mRNA分子具有5端帽子结构，而部分降解的mR能在相应的核酸3端添加一段oligo(dC)，对于非全长cDNA，NA分子没有此结构的特点，采用寡核苷酸(

8、o1ig0nucle0tide)替由于反转录没有延伸到mRNA的5端，RT不能在其不完整换mRNA的帽子结构，并标记mRNA的5端。的3端加上oligo(dC)。合成cDNA第二链时，对于截短的第首先利用细菌碱性磷酸酶(bacterialalkalinephosphatase，一链cDNA，反转录酶没有识别到mRNA的5端帽子结构，3BAP)水解5端无mGpppNp一保护的部分，降解5磷酸基团，端携带的oligo(dG)第二链引物就不能与截短的第一链cDNA并防止截短的mRNA在后续反应中与寡核苷酸连接；然后用片段结合，最终得到的是全长双链cDNA。在实验流程中

9、，烟草酸焦磷酸酶(tob