细胞培养基础及若干注意事项

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1、细胞培养基础及若干注意事项ZhijianLiu/刘志坚,PhDMarketingSpecialistThermofisherScientificMobile:15910723147Email:zhijian.liu@thermofisher.com细胞培养基础•细胞培养定义通过模拟机体内的生理条件，将从生物机体内取出的器官、组织或细胞等，在体外进行培养，并使其继续生存、生长和繁殖的过程•动物细胞培养历史1907年哈里森（Harrison）采用盖玻片覆盖凹窝玻璃悬滴培养法培养蛙胚神经组织成功1923年法国学者卡雷尔（Carrel）成功设计出卡氏培养瓶19

2、51年，厄尔利（Earle）等人开发了动物细胞体外培养的培养基1952年盖伊等于建立了HeLa细胞系（人子宫颈癌细胞系）30年代滚瓶开始使用，60年代生物反应器/微载体开始使用•细胞培养的优点（1）培养对象是活的细胞，并且能够实现较好的均一性和线性放大，适宜于各种规模的研究（2）培养条件可人为改变，并能得到严格的控制，便于研究各种物理、化学等外界因素对细胞生长、发育和分化等的影响（3）体外培养的细胞可以通过各种技术进行观察、分析，实验结果便于观察、检测和记录•细胞培养的局限性细胞体外培养体系与真正的机体内环境并不完全一致，细胞的生物学特性在一定程度上也

3、会发生改变，因此，体外培养条件下观察到的结果可能并不绝对地符合机体内细胞的真实情况5细胞培养基础•细胞体外培养形式贴壁生长：大多数哺乳动物细胞属于贴壁依赖性细胞，需要附着于一定的表面才能维持正常的生命活动悬浮生长：少数种类细胞，比如血液细胞、某些肿瘤细胞、某些模型细胞可以在悬浮状态生长，不依赖于特定表面贴壁细胞悬浮细胞需定期传代，但易于通过倒置显微镜观察较易传代，可将培养物稀释以刺激生长利用酶或机械方法解离细胞无需通过酶或机械方法解离受培养表面积限制，因而产量受限受细胞浓度限制，易于扩大培养规模需要使用经过组织培养处理的容器可使用未经组织培养处理的容器

4、进行培养，但需要搅动以便进行充分的气体交换可连续收获产物，用于细胞学研究等多种研可批量收获产物，用于蛋白质的大量生产及究领域多种研究领域6细胞培养基础细胞在体外生长的基本要求营养支持成分能量来源：主要是葡萄糖氧气氨基酸、维生素、谷氨酰胺等补充营养成分物理环境渗透压（280－330mOsm/kgH2O）温度（哺乳动物37℃）酸碱度(pH7.2-7.4)7细胞在体外生长的基本特性•自分泌/旁分泌重组蛋白表达、接种密度、冻存液、无血清培养、流动培养体系•细胞分裂中的反复贴壁培养体系、培养表面贴壁性•细胞与细胞间的直接接触贴壁生长密度、体外培养细胞功能维持AB

5、CDEFGHI8细胞来源•从厂商、机构和其他实验室获取连续传代细胞（如肿瘤细胞、胚胎干细胞等）有限传代细胞（如原代细胞等）•从固体组织提取酶解法（胰酶/EDTA、胶原酶、离散酶、透明质酸酶）细胞活性易受损，但收获率较高、所需时间短、生长时间较均一贴壁法细胞活性好，但收获率低、所需时间长、生长时间不均一•从液体组织中提取梯度离心分选：简易分离大小差别较明显的细胞基于抗体的流式和磁珠分选：深度分选带有不同表面特征蛋白的细胞，需注意保护筛选后细胞•注意事项离心养成严格平衡的习惯高速离心时样品量不宜超过离心管容积的三分之二离心速度控制：普通哺乳动物细胞150-

6、200g（1000rpm）5-6分钟9细胞培养污染示例真菌霉菌细菌螨虫支原体细胞污染对策：灭菌后丢弃，并对培养环境进行全面灭菌处理10无菌操作环境的维护•细胞感染的种类及抗生素的局限性感染种类及鉴别方法：细菌、真菌、支原体、病毒去除污染方法和抗生素的局限性•生物安全柜的使用和维护生物安全柜、超净工作台、通风橱的区别：对样品、操作者和环境的不同保护生物安全柜的分级及对建筑物空气流动的要求生物安全柜的清洁：前窗、工作表面、侧壁和台面下连续和稳定的气流对保持洁净环境的关键性及紫外灯灭菌的局限性尽量减少容器在中敞口的时间使用一次性血清移液管转移液体减少物品反复

7、进出安全柜的次数•水浴槽、离心机、冰箱污染的防护•环境及腔体灭菌高温>甲醛、双氧水、酒精>紫外线11细胞扩增培养：CO2细胞培养箱的使用和维护•CO2细胞培养箱的传统功能保持稳定均一的湿度(渗透压)、温度(酶的功能)和CO2浓度（酸碱度）•CO2细胞培养箱的新功能灭菌：处理传染性组织和细胞样本需要具备的功能：干热（140℃-180℃）灭菌：得到公认的灭菌方式特别是表面灭菌，但有些部件（如HEPA滤膜、红外CO2探头等可能需要拆下单独灭菌）湿热（90℃-95℃）灭菌：可以得到和干热灭菌类似的灭菌效果，同时箱体内部件不需要拆下单独灭菌，可一键完成甲醛

8、或双氧水熏蒸：干热/湿热灭菌技术出现之前的解决方案，有较好的灭菌效果，但对人体或环境容易造成危