大鼠miR-126慢病毒表达载体的构建及其在肝星状细胞中的表达-论文.pdf

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1、塑!!omProgressinModernBi。medicineVoL13NO~36DEC·2013．70基础研究·大鼠miR一126慢病毒表达载体的构建及其在肝星状细胞中的表达虢灿杰卞兆连盛黎马雄△(上海交通大学医学院附属仁济医院消化所及消化科上海200127)摘要目的：肝星状细胞(hepaticstellatecell，HSC)激活并发生表型改变是肝纤维化形成的关键，本实验期待通过构建慢病毒mo—miR一126，并体外转染HSC，为研究miR-126在肝纤维化中的作用奠定实验基础。方法：PCR扩增miR．126的前体，构建miR一12

2、6的重组表达载体pCDH-CMV—MCS—EF1一copGFP—miR．126，脂质体法转染包装细胞293TN细胞，包装产生慢病毒，以293TN细胞绿色荧光蛋白(greenfluorescentprotein，GFP)的表达水平测定病毒滴度，构建重组慢病毒(Lentivirus，Lv)载体(Lv—miR·126)，体外转染活化的HSC-T6，荧光显微镜观察荧光阳性细胞百分率，rea1．timePCR检测miR．126转入水平。结果：经PCR扩增检测阳性菌落和测序证实，成功构建携带大鼠miR一126基因重组慢病毒载体。倒置荧光显微镜下观察可

3、见包装细胞293TN呈绿色荧光，并测得滴度108>ifu／ml。荧光显微镜下HSC的荧光阳性率在95％以上。Real—timePCR检测证实miR．126转染后获得了较高的表达。结论：成功构建大鼠慢病毒载体Lv—miR-126，并可在体外高效稳定表达，为本研究后续对miR-126靶点验证和功能研究奠定实验基础。关键词：rno—miR-126；miRNA；慢病毒中图分类号：Q593．1，Q75，Q78文献标识码：A文章编号：1673．6273(2013)36．7001．04Constructionoftoo—miR．126Lentivira

4、lExpressionVectoranditsExpressioninHSCs水GUOCan-fie,BIANZhao-lian,SHENGLi．MAXiong~(DigestiveDiseaseLaboratoryandDepartmentofGastroenterology,RenjiHospital，SchoolofMedicine,ShanghaiJiaotongUniversity,Shanghai．200012~China)ABSTRACTObjective：Theactivationandtransformationofhe

5、paticstellatecells(HSC)isthekeylinkinthedevelopmentofhepaticfibrosis，weexpectedtoconstructalentiviralexpressionvectorforrno—miR·126andtransfecttoHSC，thuslayingascientificbasisforthestudyofmiR-126inhepaticfibrosis．Methods：Thepre—miR-126wasamplifiedbyPCRandthenconstructedth

6、erecombinantplasmidpCDH—CMV—MCS—EF1一copGFP—miR-126．293TNcellswerecotransfectedwithlentiviralvectorpCDH—CMV—MCS-EF1一copGFP-miR一126andLentivirusPackageplasmidmix．VirustiterwasmeasuredaccordingtotheexpressionlevelofGFP．ThelentiviralvectorencodingmiR-126wasconstructedandtrans

7、fected．Furthermore，theexpressionlevelofmiR-126wasmeasuredbyRT—PCR．Results：TherecombinantplasmidwasconfirmedbyrestrictionendonucleaseanalysisandDNAsequencing，The293TNshowedgreenfluores—cencewasobservedunderfluorescencemicroscopeandvirustiterwas108>ifu／m．thepositiverateofHS

8、Cismorethan95％，thehighex—pressionofmiR·126aftertransfectionwasconfirmedbyReal—timePCR．Conclusion