油菜茎基溃疡病菌基因组DNA提取方法的比较.doc

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1、油菜茎基溃疡病菌基因组DNA提取方法的比较　　摘要：比较了油菜茎基溃疡病菌基因组ＤＮＡ的尿素提取法、ＳＤＳ－ＣＴＡＢ提取法、ＣＴＡＢ提取法和试剂盒提取法的提取过程、ＤＮＡ纯度和对ＰＣＲ扩增的影响，旨在筛选能替代昂贵试剂盒法的方法。结果表明，尿素提取法可以满足ＤＮＡ的ＰＣＲ扩增要求，并取得与试剂盒提取法相似的效果。尿素提取法还具有操作简便、成本低廉等优点，在植物检验检疫中具有潜在的应用价值。　　关键词：油菜茎基溃疡病菌；ＰＣＲ；基因组ＤＮＡ；提取方法　　中图分类法：Ｓ４３５．６５４文献标识码：Ａ文章编号：0439－８11403－0511-03　　　　Ｃｏｍｐａｒisｏｎ

2、ｏｆＥｘｔｒａｃｔｉｏｎＭｅｔｈｏｄｓｆｏｒＬｅｐｔｏｓｐｈａｅｒｉａｍａｃｕｌａｎｓＧｅｎｏｍｉｃＤＮＡ　　　　ＷＡＮＧＺｈｅｎ－ｈｕａ，ＺＨＡＯＨｕｉ，ＳＯＮＧＱｉ，ＬＩＦｅｎｇ－ｘｉｎ，ＦＥＮＧＨａｎ－ｌｉ，ＹＡＮＧＷｕ，ＹＵＨａｏ，ＷＡＮＧＨａｎ－ｃｈａｎｇ　　　　　　Ａｂｓｔｒａｃｔ：ＰＣＲａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎｏｆｇｅｎｏｍｉｃＤＮＡｉｓａｇｅｎｅｒａｌｄｅｔｅｃｔｉｎｇｍｅｔｈｏｄｏｆＬｅｐｔｏｓｐｈａｅｒｉａｍａｃｕｌａｎｓ，ａｎｄｋｉｔｍｅｔｈｏｄｏｆＤＮＡｅｘｔｒａｃｔｉｏｎｉｓｍａｉｎｌｙａｐｐｌｉｅｄｂｙtheＩｎｓｐｅｃｔｉｏｎａｎｄＱｕ

3、ａｒａｎｔｉｎｅｓｙｓｔｅｍ．Ｏｎｔｈｅｐｕｒｐｏｓｅｏｆｓｃｒｅｅｎｉｎｇａｍｅｔｈｏｄｔｏｒｅｐｌａｃｅｔｈｅｅｘｐｅｎｓｉｖｅｋｉｔｍｅｔｈｏｄ，theｅｘｔｒａｃｔｉｏｎｐｒｏｃｅｓｓｅｓ，ＤＮＡｐｕｒｉｔｙａｎｄｉｎｆｌｕｅｎｃｅｓｏｎＰＣＲａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎｏｆｆｏｕｒｅｘｔｒａｃｔｉｏｎｍｅｔｈｏｄｓｗｅreａｎａｌｙｚｅｄ．ＴｈｅｒｅｓｕｌｔｓｓｈｏｗｅｄｔｈａｔｔｈｅUｒｅａｍｅｔｈｏｄｃｏｕｌｄｍｅｅｔｔｈｅｒｅｑｕｉｒｅｍｅｎｔｓofＤＮＡＰＣＲ，ａｎｄｏｂｔａｉｎｅｄａｓｉｍｉｌａｒｅｆｆｅｃｔｔｏｔｈｅｋｉｔｍｅｔｈｏｄ．Ｗｉｔｈａｄ

4、ｖａｎｔａｇｅｓｏｆｓｉｍｐｌｅｍａｎｉｐｕｌａｔｉｏｎａｎｄｌｏｗｃｏｓｔ，ｔｈｅＵｒｅａｍｅｔｈｏｄｗｏｕｌｄｈａｖｅｐｏｔｅｎｔｉａｌａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｉｎｐｌａｎｔｉｎｓｐｅｃｔｉｏｎａｎｄｑｕａｒａｎｔｉｎｅ．　　Ｋｅｙｗｏｒｄｓ：Ｌｅｐｔｏｓｐｈａｅｒｉａｍａｃｕｌａｎｓ；ＰＣＲ；ｇｅｎｏｍｉｃＤＮＡ；ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎｍｅｔｈｏｄ　　　　近几年来，进口油菜子呈大幅增长趋势，据国家粮油信息中心统计，仅２００９年进口油菜子就达２０２万ｔ。与此同时，口岸截获包括油菜茎基溃疡病菌在内的有害生物种类和数目也在大幅增加。油菜茎基溃疡病菌属于小球腔菌属，主要为害

5、油菜与其他十字花科作物，在油菜茎、叶形成灰色斑点，茎基部形成凹陷的溃疡斑，上有黑色小点；严重时，根部和种荚也受到侵染，种子带菌［１］。２００７年被列为我国对外公布的进境植物检疫性有害生物。　　目前，基因组ＤＮＡ的ＰＣＲ扩增是油菜茎基溃疡病菌的常规检测手段，而试剂盒提取法是我国检验检疫系统提取基因组ＤＮＡ的主要方法，但试剂盒价格高且常常出现供货短缺而延长检测周期等问题。为了降低实验成本，加快油菜子在口岸的通关速度，我们比较了几种油菜茎基溃疡病菌ＤＮＡ的提取方法，发现简便有效的尿素提取法可以满足该病菌基因组ＤＮＡ的ＰＣＲ扩增要求。　　１材料与方法　　１．１菌株及其培养　　

6、油菜茎基溃疡病致病菌菌株为湖北出入境检验检疫局从加拿大进口油菜子中分离，经过形态学观察和强毒株系特异性的、长为５８０ｂｐ的ＤＮＡ测序鉴定，并被华中农业大学李国庆教授鉴定为油菜茎基溃疡病菌。　　纯化的分离物接种在ＰＤＡ培养基上，２０℃黑暗条件培养１周，挑取少量菌丝用于ＤＮＡ提取实验。　　１．２ＤＮＡ提取　　１．２．１尿素提取法［２］取５００μＬ尿素提取液与１０μＬ２０ｍｇ／ｍＬ蛋白酶Ｋ至ＥＰ管中，挑取２００ｍｇ菌丝至ＥＰ管，混匀。５５℃温育３０ｍｉｎ，每隔１０ｍｉｎ振荡混匀１次，１２０００ｒ／ｍｉｎ离心５ｍｉｎ，将上清液移入另一ＥＰ管中，加入等体积的苯酚－氯仿－异戊醇溶

7、液，颠倒混匀，１３０００ｒ／ｍｉｎ离心１０ｍｉｎ；再取上清到另一ＥＰ管中加入等体积的异丙醇和１／１０体积的３ｍｏｌ／Ｌ醋酸钠，－２０℃放置２０ｍｉｎ，１３０００ｒ／ｍｉｎ离心１０ｍｉｎ；弃上清液，倒置晾干，用７０％乙醇洗涤，室温倒置于吸水纸上晾干，溶于２０μＬＴＥ溶液中，加入ＲＮａｓｅＡ１μＬ，１３０００ｒ／ｍｉｎ离心１０ｍｉｎ，弃上清，３７℃水浴３０ｍｉｎ，－２０℃保存备用。实验重复３次。　　１．２．２ＣＴＡＢ提取法［２，３］取５００μＬＣＴＡＢ提取液［、１％ＣＴＡＢ、０．７ｍｏｌ／ＬＮａＣl、１０ｍｍｏｌ／ＬＥＤＴA）］与５μＬ２－巯基乙醇至ＥＰ