基因工程-3.1载体

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1、第三章第一部分基因克隆的载体VehiclesforGeneCloning:PlasmidsandBacteriophages基因克隆载体的要求1.最重要的：能够在宿主细胞内进行复制。产生出大量重组DNA分子的拷贝并传递给子代细胞。2.有相对较小的体积，理想情况下不超过10kb。因为大分子容易在纯化过程中被折断，同时也会给其他一些操作带来困难。有两种细菌中存在的DNA分子能够满足这些条件：质粒和噬菌体染色体。2.1质粒2.1.1质粒的基本特性质粒是细菌细胞中独立存在的一种环状DNA分子(图2-1)质粒都带有一个或多个基因，这些基因的表达常常赋予宿主细胞一些有用的特征。

2、如，能够存活在含有致死浓度的氯霉素和氨苄青霉素培养基中的细胞，是因为这些细胞内的质粒中携带有相应的抗生素耐药性基因。实验室中，抗生素耐药性通常作为一种选择性标记(selectablemarker)来确认培养物中的细菌是否含有特定的质粒(图2-2)。所有的质粒都至少含有一段可作为复制起点的DNA序列，因此能够在细胞内独立于宿主细胞本身的复制周期而实现扩增[图2-3(a)]。小一些的质粒可以利用宿主细胞本身的DNA复制酶来对自身进行拷贝，而一些较大的质粒本身携带有能够编码自身质粒复制所需的专一性酶的基因。非整合型质粒整合型质粒或游离型质粒(episome)即：通过将自己

3、插入到宿主细胞染色体中来进行复制[图2-3(b)]仅占一小部分；可以以这种形式稳定存在于细胞中很多代，但也会在某些阶段以独立的成分存在。2.1.2质粒大小和拷贝数质粒大小和拷贝数对于基因克隆尤其重要。质粒的大小范围从1.0kb到250kb不等，因此只有很小一部分质粒能够在克隆试验中得到应用。拷贝数:在一个细菌细胞中通常能够找到的某个质粒的分子数。每个质粒都具备一个特征性的拷贝数(1-50)，但控制拷贝数的因素不完全了解。一般来说，一个有用的克隆载体需要以大量拷贝的形式存在于细胞中，以获得大量的重组DNA。2.1.3接合性与相容性质粒可分为两大类：接合性质粒和非接合性

4、质粒。接合性质粒:能够促进细菌细胞间的有性接合，这种转移过程是受一系列转移基因所控制，这些转移基因存在于接合性质粒中。非接合性质粒：没有上述性质和基因。但，一个非接合性质粒可以在某些环境下，在与接合性质粒共存于同一个细胞的情况下，发生协同转移。同一细胞中具有不同种类的质粒，必然包含一种接合性质粒。最多7种质粒同时存在一个细胞，质粒间彼此相容。如果两个质粒不能相容，其中一个很快从细胞中消失。根据质粒间是否具备相容性，划分成不同的不相容群体。同一群体中的质粒间经常以各种方式相关联。相容性可能与质粒复制过程有关2.1.4质粒的种类分类：基于质粒的主要特征本质是质粒的基因质

5、粒分为以下5种：(1)致育(fertility)质粒或称F质粒仅携带转移基因，能促进质粒间有性接合转移；不再具备其他的特征。如：大肠杆菌中的F质粒(2)耐药性(resistance)质粒或称“R”质粒携带有能够赋予宿主细菌对一种或多种抗菌药的耐药性的基因，如抗氯霉素、氨苄青霉素或水银。R质粒通过正常的繁殖而传播,对细菌感染的治疗产生深远的影响，如RP4，通常在假单胞菌中被发现，但也能够在其他细菌中出现(3)Col质粒编码大肠杆菌素，一种能够杀死其他细菌的蛋白，如大肠杆菌的ColE1质粒。(4)降解质粒使宿主菌能够代谢一些通常情况下无法利用的分子，如甲苯和水杨酸，如假

6、单胞菌中的TOL质粒。(5)毒性质粒赋予宿主菌致病性，比如根瘤农杆菌中的Ti质粒，能够在双子叶植物中诱导冠瘿瘤。2.1.5细菌外其他生物体中的质粒质粒：细菌中广泛存在，其他生物体中不常见。最典型的真核状态质粒—酿酒酵母菌株中观察到的2µm质粒可以根据2µm质粒构建载体来转化酵母其他真核生物中对质粒的研究令人失望2.2噬菌体2.2.1噬菌体的基本特征噬菌体：一类能够特异性侵染细菌的病毒。结构简单①一个DNA(或RNA)分子，包括与噬菌体复制有关的基因；②DNA(RNA)分子的外面包绕着一层保护性的蛋白分子构成的外衣或称衣壳。噬菌体侵染模式所有均相同，分为3步：(1)噬

7、菌体颗粒附着到细菌的外表面，并将自身的DNA染色体注入被侵染的细胞。(2)噬菌体DNA分子被复制。通常是在噬菌体自身基因编码的特异性复制酶催化下完成的。(3)其他的噬菌体基因合成构成衣壳的蛋白成分，新的噬菌体被组装起来并被从细菌中释放出来。对于一些噬菌体来说，完成整个侵染循环是一个非常迅速的过程，可能不超过20min。这种快速侵染的过程称作裂解周期，因在释放新生成的噬菌体过程中同时伴随有原细菌细胞的裂解而得名。溶解性噬菌体的标志性特征：在噬菌体DNA的复制完成后立刻开始衣壳蛋白的合成，而且噬菌体DNA分子在宿主细胞内永远都无法以稳定的状态存在.2.2.2溶源性噬