抗GRP78单克隆抗体的制备及初步鉴定.pdf

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1、ISSN1007—8738细胞与分子免疫学杂志(ChinJCellMolImmuno1)2010，26(121229·论著·文章编号：1007—8738(2010)12—1229—03抗GRP78单克隆抗体的制备及初步鉴定高慧萍，俞菁，余君铭’，孔洁，张翠珍，王华茂，龚波(上海市肿瘤研究所癌基因与相关基因国家重点实验室，上海200032；长宁区妇幼保健院，上海200051)[摘要]目的：原核表达GRP78并制备抗GRP78的特异性收试剂盒购自上海华舜生物工程有限公司。新生牛血清单克隆抗体(mAb)，并初步鉴定相应mAb的特性。方法：从(NCS)

2、、胎牛血清(FBS)购自Gibco公司。HAT、DMEM培养肺癌患者组织中抽提总RNA，RT．PCR获得grp78全长基因，基、PEG4000，(不)完全弗氏佐剂及HRP-山羊抗小鼠IgG购并通过原核重组表达GRP78蛋白；以纯化的GRP78蛋白免疫自Sigma公司。抗His—Tag抗体是GEHeahhcare产品。抗BALB／c小鼠，成功免疫的小鼠脾细胞与骨髓瘤Sp2／0细胞融GRP78抗体是Labvision／NeoMarkers公司产品。BALB／c小鼠合，筛选得到分泌特异性抗GRP78的mAb的杂交瘤细胞株；(雌性，4～6周龄，体质量1

3、6～19g，SPF环境饲养)，由上海并通过Westernblot及免疫组化初步鉴定其特异性。结果：成市肿瘤研究所实验动物中心提供[实验动物合格证号：SCXK功构建重组表达质粒PET-28a—grp78并由大肠杆菌表达获得(沪)2007-．0001]。GRP78蛋白，被该蛋白免疫的BALB／c小鼠与Sp2／0细胞融1．2方法合、筛选，获得3株稳定分泌抗GRP78抗体的杂交瘤细胞株，1．2．1grp78原核表达质粒构建将肺癌患者组织于撵钵中分别命名为2A1、4B8和4A12。采用其中1株4A12mAb对3碾碎，每100mg组织悬液加1mLTRIzo

4、l，抽提总RNA，方法个肺癌患者组织样本进行Westernblot检测以及免疫组化分同张翠珍等获得人cDNA。从GenBank获得grp78的全序析，结果均显示4A12mAb能够特异识别肺癌组织表达的列，设计上游引物5一GGCATATGAAGCTCTCCCTGGTGGCC一GRP78。结论：成功制备了抗GRP78的mAb，并能够特异识3，含NdeI酶切位点，下游引物5一GGGGATcCTACAAcT—别肺癌组织表达的GRP78，为进一步研究GRP78在肿瘤治疗cATC1-ITITrCTGcTGTATcCTC-3，含BamHI酶切位点。扩增中的作

5、用提供基础。参数为：94oC，4min，94％，50s，58％，50s，72~C，2min，[关键词】GRP78；杂交瘤；单克隆抗体72％，10min，扩增30个循环，琼脂糖凝胶电泳后回收PCR[中图分类号]Q813．2[文献标识码]B产物，经BamHI／NdeI酶切后克隆到表达载体PET-28a(+)。转化大肠杆菌Topl0，然后经PCR及酶切鉴定后，并葡萄糖调节蛋白78(glucoseregulatedprotein，通过测序确认序列正确。GRP78)，又名免疫球蛋白重链结合蛋白(theimmu．1．2．2GRP78蛋白表达纯化测序正确的质

6、粒转化BL21noglobulinheavychainbindingprotein，Bip)，是葡萄(DE3)表达菌，以0．5mmol／LIPTG诱导表达，2h后，4~C，糖调节蛋白家族成员之一。GRP78的功能很多，除作4000g，离心20min，弃上清，菌体沉淀加适量PBS重悬后为分子伴侣及内质网上的一种应激蛋白的功能外，近超声破碎，(超声参数为400W，超声3s，间隔3s，超声99年研究发现，GRP78在正常细胞中低／不表达，而在如次，4个循环)，超声上清经镍柱亲和纯化获得目的蛋白GRfy78。乳腺癌⋯、肺癌』、结直肠癌J、头颈癌J，HB

7、V．相1．2．3动物免疫取适当抗原与完全弗氏佐剂按质量比1：1关的肝癌等多种恶性肿瘤细胞中呈高表达，提示混合乳化，腹部皮下多点免疫5只BALB／c小鼠，初次免疫抗GRP78与肿瘤的发生和发展密切相关。因此，抑制原为100只／次，初次免疫后3周，采用减半抗原与不完GRP78的蛋白表达或抑制其功能可作为抗肿瘤的一个全弗氏佐剂混合乳化，每间隔2周，同法加强免疫2～3次。重要思路。我们研制了抗GRP78的单克隆抗体尾静脉取血进行间接ELISA试验检测小鼠血清效价。融合前(mAb)以期为肿瘤治疗领域提供一个有效的途径。3d进行脾内加强免疫1次。1．2．4

8、细胞融合小鼠摘眼球放血处死，取脾细胞[(1—2)×1材料和方法108]与Sp2／0细胞(脾细胞：Sp2／05：1)在PEG4000作用下进1．1材料质