细胞组织高基体粗提分离试剂盒产品.doc

《细胞组织高基体粗提分离试剂盒产品.doc》由会员上传分享，免费在线阅读，更多相关内容在行业资料-天天文库。

1、细胞/组织高尔基体粗提分离试剂盒产品说明书（中文版）主要用途细胞/组织高尔基体粗提分离试剂是一种旨在通过机械或化学处理，差速以及等密度离心方法，从动物细胞或软组织中分离出完整的高尔基体细胞器组分的权威而经典的技术方法。该技术经过精心研制、成功实验证明的。适合于各种动物细胞或组织（人体、老鼠、兔子等）样品中高尔基体的制备。可以被用于受体循环、糖蛋白和脂蛋白合成，以及抗体释放机制等研究。产品不含污染性蛋白酶和核酶，即到即用，性能稳定，分离产量高。技术背景高尔基体（Golgiapparatus或Golgibody）

2、，又称为高尔基复合体（Golgicomplex），是大多数真核细胞的细胞器组分，由40至100扁平片层或称为小池（cisternae）堆叠成内膜系统（endomembranesystem），分成正侧或内侧网络（cis-Golginetwork）、近内中间网络（medial-Golgi）、内腔网络（endo-Golgi）、外侧或反侧网络等（trans-Golgi）细胞内小管（tubules）、囊泡（vesicles）和小池（cisternae/sac）相互连接的网络结构，其主要功能在于由内侧网络接受内质网囊泡中

3、的蛋白质和脂类等生物大分子，处理（修饰、分类）和组装后，由外侧网络转运分泌到目标位置。同时也是合成蛋白聚糖（proteoglycan）和碳水化合物的重要场所。高尔基体的分离是现代细胞生物学研究的常用手段之一：第一，通过机械或化学方法破裂组织细胞；第二，通过低速差速离心去除残渣碎屑和巨大细胞器；第三，可以通过等密度离心获得高尔基体。产品内容清理液（ReagentA）毫升裂解液（ReagentB）毫升分离液A（ReagentC）毫升分离液B（ReagentD）毫升保存液（ReagentE）毫升产品说明书1份保存方

4、式保存在4℃冰箱里，有效保证6月用户自备HANK平衡盐缓冲溶液或PBS缓冲溶液：用于清理细胞胰蛋白酶乙二胺四乙酸混合液：用于细胞脱离完全细胞培养液：用于中和胰蛋白酶的细胞培养基15毫升锥形离心管：用于样品制备的容器1.5毫升离心管：用于样品保存的容器8毫升超速离心管：用于超高速离心的容器4℃（微型）台式离心机：用于样品制备4℃超速离心机：用于样品制备DOUNCE匀浆器：用于裂解组织平式摇荡仪：用于混匀3号针筒和18号针头：用于收集样品实验步骤一、细胞样品1．准备5至10瓶75cm2细胞培养瓶的细胞（5X107

5、），直至细胞生长铺满整个培养表面2．分别加入10毫升用户自备的HANK平衡盐缓冲溶液或PBS缓冲溶液到每个细胞培养瓶，覆盖培养瓶表面，然后抽去3．重复实验步骤2一次4．加入3毫升用户自备的胰蛋白酶乙二胺四乙酸混合液，铺满整个细胞生长表面5．置入37℃培养箱3分种6．轻轻手击震动培养瓶，使细胞脱落7．分别加入10毫升用户自备的完全细胞培养液8．移入一个50毫升锥形离心管9．放进台式离心机离心10分钟，速度为200g10．小心抽去上清液11．加入xx毫升预冷的清理液（ReagentA），混匀细胞12．放进台式离心

6、机离心10分钟，速度为300g13．小心抽去上清液14．加入预冷的xx毫升裂解液（ReagentB）15．涡旋震荡5秒，充分混匀16．即刻放入预冷的DOUNCE匀浆器17．在冰槽里用匀浆棒匀化组织（约20至40下）（注意：参见注意事项7）18．将所有组织匀浆物移入15毫升锥形离心管19．放进4℃台式离心机离心15分钟，速度为3000g20．小心移出上清液到另一个新的预冷的15毫升锥形离心管——21．放进－70℃冰箱里备用或放进冰槽里继续后续操作22．移取xx毫升的分离液A（ReagentC）到8毫升超速离心管

7、23．小心加入xx毫升的分离液B（ReagentD）在分离液A（ReagentC）的上面，避免震动24．轻轻加入xx毫升上述高尔基体混匀液在分离液B（ReagentD）的上面，避免震动25．放进4℃超速离心机离心4小时，速度为100000g26．小心取出超速离心管：可见样品和分离液B（ReagentD）交界处棕色或乳黄色样品带27．小心收集高尔基体样品带到8毫升超速离心管（注意：用3毫升针筒和18号针头，置于样品带下缘小心缓慢抽吸）28．加入xx毫升保存液（ReagentE）29．放进4℃超速离心机离心30分

8、钟，速度为100000g30．小心抽去上清液31．加入xx微升保存液（ReagentE），混匀32．即刻移入到预冷的1.5毫升离心管1．放进－70℃冰箱里保存一、组织样品1．手术取出动物组织，避免或去除脂肪组织，秤重以确定1克组织重量（实验前最好使动物空腹12至24小时）2．（选择步骤）放进预冷的15毫升锥形离心管3．（选择步骤）加入xx毫升清理液（ReagentA）清洗1次4．即刻用刀片切碎组织5