神经生长因子和脑源性神经营养因子对神经干细胞迁移的影响.pdf

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1、·26·黑龙江医药科学2015年6月第38卷第3期神经生长因子和脑源性神经营养因子对神经干细胞迁移的影响①魏春杰，江清林，朱晓峰(佳木斯大学附属第一医院神经三科，黑龙江佳木斯154003)摘要：目的：探讨神经生长因子(nervegrowthfactor，NGF)与脑源性神经营养因子(brain—derivedneurotrophicfactor，BD—NF)体外实验对神经干细胞迁移的影响。方法：体外应用半固体培养法连续14d观察不同浓度的NGF、BDNF及NGF+BDNF组合诱导神经干细胞迁移的情况。结果：体外条件下

2、不同浓度的神经营养因子的组间和组内比较显示，lO0~g／LBDNF诱导神经干细胞迁移作用最明显。BDNF+NGF联合组在诱导神经干细胞迁移方面未见协同效应。结论：NGF、BDNF二者皆有诱导神经干细胞迁移的作用，lO01~g／LBDNF组诱导迁移作用最明显。关键词：神经生长因子；脑源性神经营养因子；神经干细胞；迁移中图分类号：R329．23文献标识码：A文章编号：1008—0104(2015)03—0026—02神经干细胞是神经科学领域研究的热点问题，态学变化J。它的发现为神经系统疾病治疗开拓了新的前②分组：BDNF

3、：浓度1g／L、lO~g／L、lO01xg／L，景】’2J。其增殖、定向诱导分化研究方面都取得了共3组。NGF：浓度1g／L、lOp~g／L、lOOp~g／L，共3一定的成绩，但针对神经干细胞迁移方面的研究较组。BDNF+NGF：从上述6组中筛选出两种因子的少。本实验在体外条件下探讨不同浓度的NGF、最佳浓度组成1组。空白对照组：不加任何NrF。BDNF及其组合诱导NSCs迁移中的作用，并对两种免疫细胞组织化学及荧光实验：nestin标记：将因子及组合进行择优，选出最佳浓度的因子，为下一传代三次后的细胞团贴壁培养48

4、h后进行nestin免步体内实验奠定基础。疫细胞化学鉴定。数码照相机拍照，各组均设阴性1·材料和方法对照，阴性对照切片以PBS替代一抗，其余步骤相1．1材料同。Wistar新生鼠，由本校动物实验中心提供。主1．3统计学方法要试剂：DMEM／F12、B27、荧光FITC标记试剂，DAB采用SPSSIO．0软件，计量资料以均数±标准差显色试剂，BrdU、NSE、nestin、GFAP一抗，SABC—(±s)表示，多组之间两两比较用方差分析，两组FITC、SABC—CY3，EGF、bFGF、BDNF因子，羊抗小之间比较用t

5、检验，P<0．05为有统计学意义。鼠Cy3，低熔点琼脂糖。2结果1．2方法神经干细胞球贴壁培养后24h，作Nestin免疫神经干细胞的分离及培养：选用Wistar新生鼠，荧光鉴定绝大部分细胞显示nestin阳性细胞团呈绿取海马组织，经D—Hanks，液漂洗后将脑组织置入色，迁出分化的NSCs呈阴性(见图1)。连续14d观小瓶中剪碎，加人无血清培养基吹打成单细胞悬液，察接种在培养皿上的神经干细胞，见细胞生长状态台盼兰染色计数，于每个培养瓶中加入密度约为5良好，倒置显微镜下细胞折光性强(见图2)。Br×10／mL细胞悬液

6、4mL左右。置于37oC、5％CO，dU标记移植前之神经干细胞，免疫组化见大量神经饱和湿度孵育箱内培养。待原代克隆形成后再次分离制作单细胞悬液，此后每隔3d半量换液，5～7d细胞呈胞核被染色而胞浆未被染色Brdu标记阳性分离神经球进行传代J。细胞，少部分未被标记。(见图3)。镜下见BDNF半固体培养：①取盖玻片置于3．5cm培养皿底各组神经元样细胞多，胞体面积大，突起长，14d时部，基本培养液为含0．3％低熔点琼脂和2％B27的胞体多呈现三角行或多边形，分支丰富。NGF各组DMEM／F12(撤走bFGF)。在盖玻片上

7、用5％的琼细胞呈现类圆形或类星形，胞体较大，细胞伸出较多脂和神经营养因子(neurotrophicfactor，NTF)制成突起并逐渐延长，突起末端分支可见膨大的生长锥。NTF扩散源，将传代三代后得神经干细胞分散放置镜下观察见BDNF组及NGF组细胞迁出均有方向于NTF扩散源周围的盖玻片上，培养于基本培养液性趋势，但不同浓度的因子诱导NSCs迁移现象是中，观察不同因子不同浓度制成的扩散源诱导NSCs有差别的。高浓度组中细胞团细胞向培养皿中心即迁移情况，并跟踪观察各组实验细胞迁移行为及形因子扩散源方向迁出趋势明显，向这

8、一个方向伸出①基金项目：黑龙江省教育厅资助项目，编号：12521543。作者简介：魏春杰(1980～)女，黑龙江佳木斯人，硕士，主治医师。通讯作者：朱晓峰(1963～)男，山东蓬莱人，博士，教授，博士研究生导师。E—mail：sjkx2727@163．tom。HEILOI~『GJIANGMEDICINEANDPHARMACYJun．2015．V