细胞培养过程.doc

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1、细胞培养过程：复苏、换液、传代、冻存1、复苏（1）取适量培养液加入离心管中；（2）将冻存的细胞在37C水浴中快速使其融化；（3）将细胞吸入离心管中，1000r.mii?离心5min,倒去上清液，规定加入培养液，打匀，转移到培养瓶中，即可。2、换液（D将培养瓶中己变色的培养液倒掉，余液用棉花蘸掉；（2）用PBS洗涤培养瓶（从没有细胞的一侧倒掉）（3）加入新鲜培养液，即可。3、传代（细胞生长得较满、较好，分瓶后至少培养两天后再铺板）（1）将培养瓶中己变色的培养液倒掉；（2）用PBS洗涤培养瓶（细胞一侧）；

2、（3）加入2mL胰酶，静置，待细胞将脱落时，倒掉胰酶，加入培养液，打匀后，分至多个瓶中。4、冻存（1）将培养瓶中己变色的培养液倒掉；（2）用PBS洗涤培养瓶（细胞一侧）；（3）加入胰酶，静置，待细胞将脱落时，倒掉胰酶（可不倒），加入适量培养液，将贴壁细胞吹落，吸入到离心管中，1000r.miLX5min,倒掉上清液，加入900uL新生牛血清（营养来源）和100uLDMSO（保护剂）打匀后，吸到冻存管中，密封，于-80°C冻存。1.预先配制冻存液：10%DMSO+90%胎牛血清，4°C冰箱保存预冷；2.

3、用胰酶对细胞进行消化：倒去培养瓶中的培养基或用枪小心吸去培养板中的培养基，PBS冲洗两次，用联酶消化细胞（尽可能温和）；3.再次用完全培养液悬浮细胞，将预冷的冻存液加入消化完全的细胞中，用滴管轻轻吹打混匀。4.在每支冻存管中加入1ml细胞液，密封后标记冻存细胞名称和冻存口期。5.冻存步骤的细致直接关系到细胞复苏时的活力，如果有程序降温器（放在-80C冰箱过夜,放入液氮罐）最好；或者可以在402h；然后转到.2002h；・80私2h；放入液氮罐。细胞复苏1.从液氮容器中取出冻存管，直接浸入37C温水中，

4、并不时摇动令其尽快融化。2.从37C水浴中取出冻存管，打开盖子，用吸管吸出细胞悬液，加到高心管并滴加10倍以上培养液，混匀；3.离心，lOOOrpm,5min；4.弃去上清液，加入含10%小牛血清培养液重悬细胞，计数，调整细胞密度，接种培养瓶，37°C培养箱静置培养；5.次日更换一次培养液，继续培养。铺板（逐个铺板，减少污染，铺板时浓度巾低到高）（1）将培养瓶中已变色的培养液倒掉；（2）用PBS洗涤培养瓶（细胞一侧）；（3）加胰酶2mL,细胞将脱落时倒掉胰酶，加培养基少许，打匀（吹开），lOOOr.m

5、in-'XBmin,倒掉上清液，加入培养液（一般10mL,根据细胞数和铺板数量），打匀（诃用刻度吸管打匀,注意棉花塞）；（4）取lOOuIV每孔，加入到96孔板上（5000-8000个/孔）。铺板注：（1）边缘孔一般不加细胞，仅加PBS,为防止“边缘效应”引起的数据不合理，（2）加药和空白的均需加Cell（原料药SPD,先用极少量DMSO溶解，再加细胞培养液稀释到所需体积空白，即只加培养液）。96孔板12X8,周边填满，中间为60。计数：计数板先用水洗后，再用75%乙醇洗，待其干后再用。用取液枪取适量

6、溶液加入到计数板上，显微镜下观察计数（个数XlO’/mL）流式细胞仪流程：1、基本操作：（1）、收集细胞：胰能消化各孔（6孔板），收集到离心管，离心得沉淀;（2）、用PBS打匀，洗1・2遍，离心，沉淀；（3）、沉淀的细胞中加入500uL缓冲液，得悬液;（4）、^5uLAnnexinV-FITC（细胞凋亡检测试剂盒），混匀;(5)、5uLPl混匀;（4）.（6）三组需要避光操作!66）、流式细胞仪测定。（4X1©/孔,6孔板,2mL/孔）若第二天流式测量,可加5—10mL7。％乙醇,在4P固定8h以上。

7、2、制备细胞凋亡单染管：（1）、活细胞（2）、一半活细胞+一半死细胞（高温灭活■水浴90°C）+FITC（染色活Cell）（3）、一半活细胞+—半死细胞+PI（PI-碘化丙陇染色核酸，但不能穿透细胞膜即染色死Cell）（4）、一半活细胞+一半死细胞+HTC（碱性环境与抗体蛋白反应，主要是与赖氛酸的氛基与荧光素的硫碳胺键结合，形成FITC-蛋白质结合）+P1PBS的配制:（lOOOmL）NaCI8.0g、KC10.2g、KH2PO40.2g、Na2HPO4.12H2O2.9g加超纯水至lOOOmL高压蒸

8、汽灭菌，4°C储存，备用。细胞器具清洗：瓶、管等+洁消精（过夜12h）,自来水冲洗25遍，蒸偕水冲1-2遍，蒸僵水泡过夜12h,烘干，高压蒸汽灭菌（约2h），再烘干，至少2.3天，方可用。MTT溶液的配制：MTT浓度为5mg/mL,溶于PBS或无酚红的培养基中，用0.22um滤膜过滤以除去溶液里的细菌，放4°C避光保存即可。注：（1）在酶标仪检测结果时，为保证实验结果的线性，MTT吸光度最好在0.0.7范围；（2）MTT一般现用现配，过滤后4C,避光保存