实验---PCR扩增目的基因.doc

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1、实验PCR扩增目的基因一、实验目的通过本实验学习PCR反应的基本原理与实验技术。二、实验原理多聚酶链式反应（polymerasechainreaction,PCR）基本原理类似于DNA的天然复制过程，其特异性依赖于与靶序列两端互补的寡核苷酸引物。PCR由变性、退火、延伸三个基本反应步骤构成。1.模板DNA的变性：模板DNA经加热至93℃左右一定时间后，使模板DNA双链或经PCR扩增形成的双链DNA解离，使之成为单链，以便它与引物结合，为下轮反应作准备；2.模板DNA与引物的退火（复性）：模板DNA经加热变性成单链后

2、，温度降至55℃左右，引物与模板DNA单链的互补序列配对结合；3.引物的延伸：DNA模板－引物结合物在TaqDNA聚合酶的作用下，以dNTP为反应原料，靶序列为模板，按碱基配对与半保留复制原理，合成一条新的与模板DNA链互补的半保留复制链重复循环变性、退火、延伸三过程，就可获得更多的“半保留复制链”，而且这种新链又可成为下次循环的模板。每完成一个循环需2～4分钟，2～3小时就能将待扩增的目的基因扩增放大几百万倍。典型的PCR反应体系由如下组分组成：DNA模板、反应缓冲液、dNTP、MgCl2、两个合成的DNA引物、

3、耐热Taq聚合酶。三、仪器与试剂l1.仪器与耗材：PCR热循环仪，琼脂糖凝胶电泳系统，移液枪、PCR管。2.试剂（1）10×PCRBuffer（2）dNTP（其中包括dATP、dCTP、dGTP与dTTP；每种浓度均为2.5mmol/L）（3）M13Forward和Reverse引物（10μM）（4）DNA模板（质粒DNA，100ng/μL）（5）TaqDNA聚合酶（5U/μL）l四、实验步骤1.反应体系：在RCR管中加入以下反应体系。反应物体积/μL10×PCR缓冲液2.52.5mmol/LdNTP1.0上游引物

4、1.0下游引物1.0TaqDNA聚合酶0.2模板DNA(1ng/μL)1.0加ddH2O至25μL18.32.反应条件：在PCR热循环仪上设置以下程序，按程序设置的条件进行扩增。  （1）94℃预变性5min； （2）94℃变性45s; （3）55℃退火45s； （4）72℃延伸60s； （5）重复步骤（2）～（4）30次； （6）72℃延伸10min； （7）4℃∞。3.琼脂糖凝胶电泳分析PCR结果配制1％琼脂糖凝胶，取10μL扩增产物电泳。保持电压120V。电泳结束后，在紫外灯下观察结果。五、实验结果及分析六、

5、思考题影响PCR反应效率的因素有哪些？