青虾血蓝蛋白基因的克隆、表达分析及多克隆抗体的制备.pdf

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1、中国水产科学2014年3月，21(2)：235—243JournalofFisherySciencesofChina研究论文DoI：10．3724／SP．J．1118．2014．00235青虾血蓝蛋白基因的克隆、表达分析及多克隆抗体的制备孙盛明，戈贤平，一，傅洪拓，朱健，张世勇2，乔慧1．中国水产科学研究院淡水渔业研究中心，农业部淡水渔业与种质资源利用重点实验室，江苏无锡214081；2．南京农业大学无锡渔业学院，江苏无锡214081摘要：应用RACE技术克隆了青虾(Macrobrachiumnipponense)的基因全长cDNA序列，并对该基因序列特征进行了分析。青虾基因cDN

2、A全长2235bp，包括l0bp的5味端非翻译区(UTR)，2074bp的开放阅读框(ORE)，15lbp的3'UTR，开放阅读框编码688个氨基酸。蛋白相似度比对显示，青虾血蓝蛋白含有典型的6个保守的铜离子结合位点。系统进化树分析表明，青虾与脊尾白虾(Exopalaemoncarinicauda)胁聚在一起，具有最近的亲缘关系。荧光定量PCR检测显示，Hc基因在青虾不同组织中均有表达，其表达量在肝胰腺中最高；使用荧光定量PCR检测青虾，c基因在低氧胁迫和复氧条件下在肝胰腺中的mRNA时空表达情况，结果显示，经低氧和复氧刺激后，与对照组相比，Hc在肝胰腺中的表达量分别在低氧胁迫12

3、h、24h和复氧6h出现了3次明显上调，由此推测Hc基因参与低氧应激分子过程。此外，本研究通过血蓝蛋白的分离纯化技术制备了多克隆抗体，本研究结果可为更进一步的了解青虾血蓝蛋白的生理功能提供理论支撑。关键词：青虾；血蓝蛋白；基因克隆；低氧胁迫；复氧刺激；多克隆抗体中图分类号：$941文献标志码：A文章编号：1005—8737一(2014)02—0235—09血蓝蛋白(hemocyanin)是存在于节肢动物和血蓝蛋白基因大亚型的克隆研究尚未见报道。软体动物血淋巴中的含铜蛋白，与蚯蚓血红蛋白青虾是中国淡水养殖虾蟹类的重要种类[1o-¨]，(hemerythrin)和血红蛋白(hemogl

4、obin)并称为动物然而青虾对低氧环境耐受性较差是制约青虾高密进化过程中的3种重要的呼吸蛋白。近年来引起度养殖的主要瓶颈。最新报道表明，甲壳动物学术界重视的是血蓝蛋白具有多种生物学功能。血蓝蛋白是HIFs潜在的调控靶基因，血蓝蛋白启鉴于该蛋白所表现出的酚氧化物酶活性[1-2】、血细动子中含有HIFl结合位点，其核心序列为5．胞凝集活性引、抗病毒和抗等免疫学功能，RCGTG一3，称为缺氧反应元件(hypoxiaresponse为了深入阐明甲壳类血蓝蛋白的生理功能，其element，HRE)J。因此深入研究青虾血蓝蛋白基因cDNA序列已相继被克隆【6培]。考虑到凡纳滨对虾功能来揭示低氧

5、应激分子机制显得尤为重要。本研itopenaeusvannamei)具有大小两个血蓝蛋白亚究采用RACE(RapidAmplificationofcDNAEnds1型，笔者推测青虾(Macrobrachiumnipponense1方法从青虾精巢中克隆出血蓝蛋白基因的全长血蓝蛋白基因也具有两个亚型。迄今，青虾血蓝cDNA，并对其进行了序列特征分析、低氧和复氧刺蛋白基因小亚型的克隆工作已经完成[9]，而青虾激时空表达分析以及多克隆抗体制备等相关研究，收稿日期：2013．07—25；修订日期：2013．08．26．基金项目：国家科技支撑计划项目(2O12BAD26BO4；2Ol2BAD2

6、5B07)．作者简介：孙盛明(1983一)，男，博士；主要从事水产动物生理学研究．E．mail：sunsm@frc．ca通信作者：戈贤平，研究员，博士生导师；研究方向为水产健康养殖．Tel：0510．85557892；E—mail：gexp@frc．cn网络出版地址：http：llwww．cnki．net／kcms／detail／11．3446．S．20131204．10l1．o01．html网络出版时间：2013．12．0410：11236中国水产科学第21卷为进一步揭示血蓝蛋白基因的结构和功能积累资料，5种组织各1O0mg用于总RNA的提取。用消毒也为甲壳动物低氧应激调控机制的

7、研究奠定基础。的5号针头和1mL注射器从青虾心脏处抽取血淋巴，注射器中预先加入已灭菌的预冷抗凝剂使1材料与方法血液与抗凝剂最终体积比为1：1，将收集好的血1．1材料淋巴于4"C3000r／min离心20min，弃上清，1．1．1实验虾实验青虾为野生青虾，采自太湖所得沉淀即为血细胞。RNA提取方法按照RNAiso无锡湖区。野生青虾暂养在实验室1周，24h充氧Plus的操作步骤进行研磨、组织裂解后用传统的并维持水温在26～28~C，日换水量约为总水量的酚仿抽提法提取总RN