基因敲除技术.ppt

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1、基因定点敲除技术2概念基因敲除(knockout)技术是20世纪80年代发展起来的。是指一种遗传工程基因修饰技术，针对某个感兴趣的遗传基因，通过一定的基因改造过程，令特定的基因功能丧失，并研究可能进一步对相关生命现象造成的影响，进而推测该基因的生物学功能。31.锌指核酸酶(ZFNs)2.TALENs3.CRISPR-Cas941、锌指核酸酶(zincfingernuclease,ZFNs)又名锌指蛋白核酸酶，不是自然存在的，而是一种人工改造的核酸内切酶(图1)，由一个DNA识别域和一个非特异性核酸内切酶构成，其中DNA识别域赋予特异性，在DNA特

2、定位点结合，而非特异性核酸内切酶赋剪切功能，两者结合就可在DNA特定位点进行定点断裂。图1.结合到DNA(橙色)上的锌指核酸酶(蓝色)，图片来自维基共享资源，ThomasSplettstoesser5结构6利用ZFNs进行基因打靶的试验步骤（1）确定ZFN靶位点的DNA序列（2）设计和选择可识别靶位点的锌指蛋白(ZFPs)（3）利用已选择和设计的锌指蛋白组装ZFNs（4）单独将ZFNs转入正常细胞诱导目标基因发生DSB，则可激活NHEJ修复机制，或许将ZFNs和与目标基因同源的供体DNA一同转入正常细胞，则可以激活HR介导的DSB修复机制，并产生

3、出变异群体（5）检测与研究供体DNA模板在特异位点所引起的基因变异与基因修复情况（6）还需要通过Southern杂交来检测供体DNA序列并没有整合到细胞基因组的其他位点78锌指核酸酶ZFNs在植物基因组定点改造上的可能前景，但由于ZFNs的合成组装技术难度大，一般实验室难以实施，而且ZFNs易于对基因组进行非特异性切割，或对靶点DNA切割效率低，一直限制其进入实际应用ZFNs的优缺点：92009年，Boch等和Moscou等关于黄单胞菌效应子蛋白TAL效应子（transcriptionactivator-likeeffector）与寄主靶基因DN

4、A特异性识别分子密码的破解，使植物基因组定点改造呈现出新的曙光。2011年8月来自SangamoBioSciences公司和哈佛大学的两个研究小组分别利用TALENs技术进行了基因组靶向修饰相关研究，并成功敲除了人类细胞靶向基因和调控内源性基因的转录。2013年，首尔国立大学化学系和国家基因工程创新举措研究中心的Kim课题组建立了一个全基因组规模的TALEN体系。他们系统地选取了人类基因组中高度特异性的序列作为靶点以避开脱靶效应。通过高通量克隆体系，一次性构建了近2万个编码蛋白基因的TALEN质粒。2014年2月，北京大学生命科学学院魏文胜课题组

5、依托于一种自主研发的TALE蛋白组装技术完成了全部TALE元件的解码工作。102、TALENs中文名是转录激活因子样效应物核酸酶，TALENs是一种可靶向特异DNA序列的酶，它借助于TAL效应子一种由植物细菌分泌的天然蛋白来识别特异性DNA碱基对。TAL效应子可被设计识别和结合所有的目的DNA序列。对TAL效应子附加一个核酸酶就生成了TALENs。TAL效应核酸酶可与DNA结合并在特异位点对DNA链进行切割，从而导入新的遗传物质。11基因敲除步骤：（1）分析和确定待改良性状及其目标基因（2）针对目标基因DNA序列构建1对（或多对）TALENs表达

6、基因盒，并将其装载入合适的植物表达载体。（3）利用农杆菌介导法等遗传转化途径，将TALENs表达基因盒导入目标植物细胞（4）分化获得转TALENs基因植株（5）对转基因植株进行剪切位点的DNA序列分析及目标基因的表达分析（6）对转基因植株进行表型检测，包括目标基因性状和其它主要农艺性状（7）转基因植株通过自交或与其它材料杂交，筛选剔除转入的外源DNA片段、同时目标基因又得到修饰了的转基因植株（8）与常规育种技术结合，培育剔除不利性状基因或激活目标基因的植物新品种。1213优势：(1)TALE的核酸识别单元与AGCT有恒定的对应关系(2)靶序列识别

7、模块不受上下游影响，特异识别并打断基因组中的任意靶序列。(3)毒性低、脱靶情况少(4)成对的TALE识别模块保证了基因敲除靶点的准确性。缺点:模块组装过程繁琐，一般需要求助于外包公司14结构15优缺点：相比于传统的锌指核酸酶(ZFNs)技术，TALENs具有独特的优势：设计更简单，特异性更高。缺点有：具有一定细胞毒性，模块组装过程繁琐，一般需要求助于外包公司。163.CRISPR-Cas92013年1月份，美国两个实验室在《Science》杂志发表了基于CRISPR-Cas9技术在细胞系中进行基因敲除的新方法，一种全新的人工核酸内切酶cluste

8、redregularlyinterspacedshortpalindromicrepeats(CRISPR)/CRISPR-associ