甲胎蛋白检测实验.ppt

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1、甲胎蛋白检测实验2016年12月28日Part1Part2Part3目录实验步骤实验目的实验原理结果与分析Part4实际应用Part51.判断该方法检测甲胎蛋白的难易程度。2.实验该方法是否便于作为临床检测甲胎蛋白使用。实验目的实验原理原理与Southern或Northern杂交方法类似，但WesternBlot采用的是聚丙烯酰胺凝胶电泳被检测物是蛋白质“探针”是抗体“显色”用标记的二抗。聚丙烯酰胺凝胶是由单体丙烯酰胺(Acr)、N,N-甲叉双丙烯酰胺(Bis)和催化剂(AP)、加速剂(TEMED聚合成的三维网孔结

2、构(凝胶）。据有无浓缩效应可将电泳分为两类：(1)连续系统：缓冲液pH值、凝胶浓度相同，带电粒子靠电荷及分子筛效应区分。(2)不连续系统：缓冲离子成分、pH值、凝胶浓度不同，带电粒子在电场中由电效应、分子筛效应、浓缩效应区分。SDS-PAGE的原理是：依靠SDS带有大量负电荷来掩盖蛋白质表面的净电荷：同时由于在电泳溶液中加入了SDS和巯基乙醇，因此它还可以改变蛋白质构象：原理原理以固相载体上的蛋白质或多肽作为抗原，与对应的抗体免疫反应，再与酶或同位素标记的第二抗体起反应，经过底物显色或放射自显影以检测电泳分离的特异

3、性目的基因表达的蛋白成分。技术流程实验步骤(一)蛋白质的聚丙烯酰胺凝胶电泳1.制胶（1）将配制好的分离胶液倒入两块玻璃板之间的凝胶室中，待胶液加至距短玻璃板顶端约1.5cm处时停止灌胶，然后在胶液表面上小心加入厚约0.5cm的水层（2）待凝胶和水之间出现清晰界面时，说明分离胶已聚合，大约30min完成聚合。倾去分离胶上层的水，将配制好的浓缩胶液加到分离胶上，至接近短玻璃板的顶端，插上样品梳，放置待其聚合。30％丙烯酰胺贮备液：29.2g丙烯酰胺，0.8g甲叉双丙烯酰胺，加重蒸水至100ml。浓缩胶缓冲液：0.5mo

4、l/LTris-HCl，pH6.8。分离胶缓冲液：3mol/LTris-HCl，pH8.9。10％过硫酸铵：临用前用蒸馏水配制。10％SDS10％TEMED封闭液及抗体稀释液：5％脱脂奶粉-TBS，每组配10ml。底物溶液：2.5mg二氨基联苯胺（DAB）+10mlTBS+10μlH2O2，临用前配制。电极缓冲液：甘氨酸11.28g,SDS0.4g,Tris2.4g,加水至800ml，pH8.3。样品缓冲液：0.1mol/LTris-HCl缓冲液，pH6.8，20％甘油，4％SDS，10％巯基乙醇，0.005％溴酚

5、兰。TBS（Tris-HCl,NaCl）缓冲液：20mmol/LTris-HCl,500mmol/LNaCl，pH7.5，每组配150ml。TBST：取100mlTBS，加250μl20％Tween-20。材料及常用试剂(二)蛋白质从SDS聚丙烯酰胺凝胶转移至固相支持体1.放置NC膜和胶条：⑴.切割与胶尺寸相符的硝酸纤维素膜，用甲醇浸泡15s,水2min,再浸入转移缓冲液中。⑵.准备2张滤纸和海绵一起浸泡在转移缓冲液中。⑶打开转移转移槽的胶板，依次放入：a.一张浸湿的海绵b.一张浸湿的滤纸c.用转移缓冲液冲洗过的胶

6、，并小心地赶走滤纸和胶之间的气泡d.硝酸纤维素膜，在膜的右下角剪一小角，以标明电泳方向e.一张浸湿的滤纸f.一张浸湿的海绵。2.配制电极缓冲液：甘氨酸14.1g，SDS0.5g，Tris3g，加水至1000ml，pH8.3。每组配1000ml。3.制样：5μl人血清，加45μl水，再加50μl加样缓冲液。沸水浴加热8分钟，10000rpm离心2分钟,取上清液作为样品。另按说明书制备好蛋白质分子量标准样品。4.加样：（1）加入电极缓冲液，拔出胶的样品梳；（2）选3个样品槽，用微量进样器加样，中间槽加入5μl分子量标准

7、蛋白样品，两旁槽各加入10μl人血清样品。5.电泳稳压120V/200V电泳，当溴酚蓝前沿到达距底部0.5cm左右时，停止电泳。(二)蛋白质从SDS聚丙烯酰胺凝胶转移至固相支持体按胶侧为负极，膜侧为正极的方向放入转移电泳槽中，加转移缓冲液至满。插好转移电泳装置的电极，打开电泳仪开关调至稳压130V，电转1h，转移结束后打开胶板取出硝酸纤维素薄膜。(三)对固定于硝酸纤维素滤膜上的甲胎蛋白进行染色1.封闭：加封闭液1ml，37℃摇床上摇动1h.（1）与第一抗体结合弃封闭液，加入适当稀释的1ml第一抗体溶液，封口后37℃

8、摇床上轻轻摇动2h。取出膜，用TBST洗膜3次，每次5min。再封入一新的塑料薄膜袋内。（2）与酶标第二抗体结合加入适当稀释的1ml辣根过氧化物酶标记，37℃摇床上轻轻摇动1h。取出膜，用TBST洗3次，每次5min，最后用TBS溶液洗1次，以去除Tween-20。2.加底物溶液显色将膜浸入10ml底物溶液中，至显色清楚后，用水清洗，以除去多余的底物。转入水