蛋白质磷酸化概述.doc

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1、蛋白质磷酸化概述蛋白质磷酸化是敏感而可逆地调节蛋白质功能的一种最常见和最重要的机制，是调节细胞增值的基础。很多多肽生长因子(血小板来源的生长因子和表皮生长因子)和细胞因子(白细胞介素-2、集落刺激因子-2和γ-干扰素)在与其受体结合后均激发磷酸化作用，而这些被诱导的磷酸化反过来激活细胞质内的蛋白激酶如raf、MEK和MAP。此外，在所以有核生物中，细胞周期中G1/S期和G2/M期的转换均受依赖细胞周期蛋白的蛋白激酶(CDK)的调节。磷酸化作用也控制着分化和发育，如果蝇视网膜的R7细胞和秀丽新小杆线虫(Ca

2、enorhabditiselegans)的阴门发育受控于受体蛋白激酶和胞内蛋白激酶。最后，新陈代谢受磷酸化作用的调节控制，尤其是葡萄糖和糖元的相互转换及葡萄糖的转运的代谢作用。因而，形形色色的生物学家为了弄清楚他们最感兴趣的基因及其编码产物的调控和功能，他们常常不约而同，有时还是不由自主地必须蛋白质地磷酸化。研究蛋白质磷酸化最常用地方法是利用32P标记的无机磷酸盐（32Pi）进行生物合成标记。这种方法非常简单，而只将标记物中加入到培养基中。在17.2节中描述了用32Pi进行生物成标记的一般方法。该方法能达

3、到最大限度的提高掺入效率和降低放射性对工作人员的伤害及对设备的污染。大多数蛋白质是在丝氨酸和苏氨酸残基上磷酸化，而许多与信号传导有关的蛋白质还在酪氨酸位置上被磷酸化。这三种羟基磷酸氨基酸在酸性PH条件下化学性质稳定，酸水解后它们可被回收并被直接鉴定出来。在17.3节中介绍了通过酸水解和双向薄层电泳鉴定磷酸丝氨酸、磷酸苏氨酸和磷酸酪氨酸的技术。蛋白质也可在组氨酸、半胱氨酸和天冬氨酸位置上与磷酸共价键合，它们可以是以磷酸－酶的中间体或稳定修饰物的形式存在，这些磷酸氨基酸在酸性条件下不稳定，不能用对酸稳定磷酸氨

4、基酸的标准技术来研究，它们只能通过排除法或演绎法来鉴定。研究这些酸不稳定的氨基酸已超出本书的范围，读者可以参考《酶学方法》（MethodsinEnzymolcgy）第200卷有关鉴定这些新磷酸氨基酸的技术。磷酸酪氨酸不是含量丰富的磷酸氨基酸，因而一般很难在用32Pi标记的样品中检出，尤其是当样品中含有大量在丝氨酸残基上磷酸化的蛋白质或有RNA污染时则更难。凝胶电泳分级后的样品以碱处理，使RNA水解并使磷酸丝氨酸脱磷酸，可以大大提高磷酸酪氨酸和磷酸苏氨酸的检出率，在17.3节中描述一种碱处理的简单方法。如果

5、蛋白质被磷酸化，无需借助生物合成标记方法也可鉴定磷酸氨基酸。例如，蛋白质中所含的稀有的磷酸酪氨酸可用抗磷酸酪氨酸的抗体来检测，其特异性和敏感性相当高。更普遍的是，蛋白质的磷酸化常常使蛋白质在SDS－聚丙烯酰氨凝胶电泳中的迁移率发生变化，而且几乎总是改变它的等电点。将蛋白质和磷酸酶共同温育后，从凝胶迁移率的变动可以推论出非标记蛋白质存在磷酸化残基。这种方法在内源性ATP以[γ-32P]ATP进行标记的效率很差时很实用，如目的蛋白是来源于某些难以进行生物合成标记的组织或来源于体外翻译的情况。在17.4节讨论了

6、用针对磷酸酪氨酸的抗体进行免疫印迹以检测磷酸酪氨酸和通过酶法使蛋白质脱磷酸的方法。为测试磷酸化方式的功能效应，磷酸蛋白质可在体外脱磷酸基。17.5节描述了使用普通性或选择性逆转磷酸化作用的酶的策略和方法，以及通过分析32P标记磷酸基的去除或电泳迁移的改变的检测方法。对最普通的蛋白质激酶分析方法的概述（见17.6）提供读者鉴定和测量蛋白质激酶活性的条件。这里描述的最主要的激酶是酪氨酸激酶、环核苷依赖激酶、酪蛋白激酶、蛋白激酶C、Ca2＋/钙调蛋白依赖激酶。细胞短暂的化学渗透可允许将细胞不可渗透试剂导入细胞外

7、周成分以研究信号转导过程。17.7节描述了此方法作为17.2节标记方法的补充。